SCN1A是編碼電壓門控鈉離子通道Nav1.1的a亞基的基因。臨床上檢測到的該基因突變會(huì)導(dǎo)致Nav1.1功能呈現(xiàn)增強(qiáng)、或喪失兩種截然相反的改變。盡管利用不同體系對該基因突變造成癲癇病因的研究已持續(xù)了幾十年之久,但至今對此問題仍無確定答案。部分原因在于以往使用的研究體系本身具有局限性,因此,在本課題中,我們將CRISPR/Cas9及TALEN介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)應(yīng)用到iPSC的癲癇模型中,來研究SCN1A功能喪失型突變導(dǎo)致癲癇的病因。通過在iPS細(xì)胞水平上敲入紅色熒光蛋白基因tdTomato來標(biāo)記神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)中的GABA能神經(jīng)元亞型,我們首次在病人來源的神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)中對表達(dá)Nav1.1的神經(jīng)元亞型做了電生理檢測。同時(shí),我們對網(wǎng)絡(luò)中自發(fā)抑制性及自發(fā)興奮性突觸后電活動(dòng)進(jìn)行了分析。首先,我們對來自病人的突變c.A5768G進(jìn)行了體外轉(zhuǎn)染體系的檢測,結(jié)果表明該突變在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中正常表達(dá),但通道無或僅有極小鈉電流。對該病人iPS細(xì)胞分化得到的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中的GABA能神經(jīng)元進(jìn)行電生理研究發(fā)現(xiàn),c.A5768G突變不僅使神經(jīng)元上Nav的通道電流降低,同時(shí)會(huì)使Nav的激活曲線右移。而Nav通道的改變進(jìn)一步使GAB... 

【文章頁數(shù)】：107 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 緒論
    1.1 引言
    1.2 癲癇概述
        1.2.1 癲癇發(fā)作的分類
        1.2.2 癲癇的病因
        1.2.3 癲癇的治療
    1.3 離子通道概述
        1.3.1 電壓門控的離子通道
        1.3.2 配體門控的離子通道
    1.4 膜片鉗技術(shù)概述
        1.4.1 膜片鉗技術(shù)的基本應(yīng)用
    1.5 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞技術(shù)概述
        1.5.1 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展
        1.5.2 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞技術(shù)的應(yīng)用
    1.6 基因編輯技術(shù)概述
        1.6.1 基因編輯技術(shù)發(fā)展簡史
        1.6.2 基因編輯技術(shù)的應(yīng)用
    1.7 Nav1.1突變導(dǎo)致癲癇概述
        1.7.1 Nav1.1突變類型與突變效應(yīng)的關(guān)系
        1.7.2 Nav1.1在大腦中的表達(dá)
        1.7.3 SCN1A突變造成癲癇的機(jī)制研究
    1.8 課題概述
        1.8.1 研究方法與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
第二章 材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 本課題使用質(zhì)粒
        2.1.2 本課題涉及的細(xì)胞株
        2.1.3 儀器
        2.1.4 電生理實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑、藥品
        2.1.5 細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑
        2.1.6 試劑盒、工具酶
        2.1.7 其他
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 病人iPS細(xì)胞重編程
        2.2.2 iPS細(xì)胞培養(yǎng)
        2.2.3 iPS細(xì)胞多能性鑒定
        2.2.4 TALEN介導(dǎo)的基因修復(fù)
        2.2.5 CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因敲入
        2.2.6 體外誘導(dǎo)神經(jīng)元分化
        2.2.7 Nav1.1的外源轉(zhuǎn)染
        2.2.8 電生理實(shí)驗(yàn)
        2.2.9 蛋白提取和Western blot實(shí)驗(yàn)
        2.2.10 免疫熒光實(shí)驗(yàn)
        2.2.11 流式細(xì)胞分選實(shí)驗(yàn)
        2.2.12 數(shù)據(jù)分析
第三章 結(jié)果與討論
    3.1 結(jié)果
        3.1.1 癲癇病人描述
        3.1.2 癲癇病人突變效應(yīng)鑒定
        3.1.3 病人iPS細(xì)胞的重編程及修復(fù)
        3.1.4 神經(jīng)元的誘導(dǎo)分化
        3.1.5 CRISPR/Cas9介導(dǎo)的tdTomato基因敲入
        3.1.6 Nav1.1離子通道主要表達(dá)在tdTomato陽性的GABA能神經(jīng)元中
        3.1.7 病人來源的tdTomato陽性GABA能神經(jīng)元中鈉通道功能改變
        3.1.8 癲癇病人來源的GABA能神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢话l(fā)放能力變?nèi)?br>        3.1.9 神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)中自發(fā)突觸后電流分析
        3.1.10 神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)中Nav1.1總蛋白表達(dá)量分析
    3.2 討論
    3.3 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
在讀期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與取得的其他研究成果



本文編號：3700204