背景及目的：腓骨肌萎縮癥（Charcot-Marie-Tooth disease, CMT）,又稱遺傳性運動感覺性神經(jīng)�。℉ereditary motorsensory neuropathy, HMSN）,是一組最常見周圍性基因遺傳病。CMT1型約占CMT總數(shù)的50%,其中以PMP22基因大片段串聯(lián)重復(fù)突變所致CMT1A最常見,占CMT1型的70%。CMT2型主要遺傳方式為常染色體顯性遺傳,占CMT的20%-40%左右,其中最常見類型為MFN2基因突變導(dǎo)致的CMT2A型,約占CMT2型的8%-33.3%。CMTX型在所有CMT型患者中所占比例約為10%～15%,CMTX中最常見的為顯性遺傳CMTX,即CMTX1型,由CX32基因突變導(dǎo)致,占了CMTX型中近90%。至今CMT己50個位點及30多個基因被定位,研究發(fā)現(xiàn)CMT并不具有很好的基因-表型相關(guān)性,即使是同一家系內(nèi)同一基因突變導(dǎo)致的不同患者臨床表現(xiàn)均不完全一致。在CMT疾病診斷方面,系統(tǒng)、方便有效的基因診斷流程的建立非常必要。本課題針對CMT最常見致病基因PMP22、CX32、MFN2展開突變篩查工作,同時構(gòu)建CX32（c.65G&... 

【文章頁數(shù)】：72 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
資助基金
目錄
第一章 前言
第二章 材料與方法
    2.1 主要實驗儀器、試劑與耗材
        2.1.1 主要實驗儀器
        2.1.2 主要的試劑與耗材
        2.1.3 主要溶液的配置
    2.2 CMT1A致病PMP22基因重復(fù)特異REP連接片段的PCR-雙酶切
        2.2.1 研究對象
        2.2.2 gDNA抽提及定量
        2.2.3 PMP22等位基因特異PCR雙酶切
        2.2.4 PCR反應(yīng)體系及擴增條件
        2.2.5 PCR擴增產(chǎn)物電泳驗證
        2.2.6 雙酶切驗證
    2.3 CMTX1致病CX32基因PCR-直接測序
        2.3.1 研究對象及gDNA抽提及定量
        2.3.2 CX32目的基因片段擴增
    2.4 CMT2A致病MFN2基因PCR-直接測序
        2.4.1 研究對象及gDNA抽提及定量
        2.4.2 MFN2目的基因片段擴增
A)位點突變致CMT的表達(dá)研究分析">    2.5 CX32基因65(G>A)位點突變致CMT的表達(dá)研究分析
        2.5.1 PCR擴增目的片段
        2.5.2 目的片段驗證及PCR產(chǎn)物純化
        2.5.3 純化產(chǎn)物加A尾(A-tailing)
        2.5.4 低熔點瓊脂糖凝膠跑膠回收產(chǎn)物
        2.5.5 PCR產(chǎn)物與pGEM-T載體的鏈接反應(yīng)
        2.5.6 T鏈接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
        2.5.7 挑選克隆搖菌
        2.5.8 菌液PCR鑒定+保菌
        2.5.9 抽提質(zhì)粒
        2.5.10 鑒定克隆
        2.5.11 pGEM-T載體酶切目的片段鏈接至pEGFP-N1質(zhì)粒
        2.5.12 pEGFP-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、挑克隆、搖菌、保菌、抽質(zhì)粒、質(zhì)粒鑒定(步驟大致同前)
        2.5.13 pEGFP-N1-mtCX32(F-R-15815)、pEGFP-N1-wtCX32(F-R-582)轉(zhuǎn)染入Hela人宮頸癌傳代細(xì)胞
        2.5.14 細(xì)胞制片
第三章結(jié)果
    3.1 CMT1A致病PMP22基因重復(fù)特異REP連接
        3.1.1 PMP22基因重復(fù)特異REP連接片段的PCR產(chǎn)物
    3.2 CMTX1致病CX32基因PCR-直接測序結(jié)果
    3.3 CMT2A2致病MFN2基因PCR-直接測序結(jié)果
A)質(zhì)粒構(gòu)建、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染實驗結(jié)果">    3.4 CX32(c.65G>A)質(zhì)粒構(gòu)建、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染實驗結(jié)果
A">        3.4.1 PCR產(chǎn)物直接測序進行驗證,突變型c.65G>A
        3.4.2 轉(zhuǎn)化
        3.4.3 成功構(gòu)建pEGFP-N1-wtCX32及pEGFP-N1-mtCX32質(zhì)粒測序驗證對照
A)轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞">        3.4.4 CX32(c.65G>A)轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞
第四章 討論
    4.1 CMT常見致病基因PMP22、CX32、MFN2基因突變檢測結(jié)果分析
    4.2 CX32功能表達(dá)研究
第五章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄 PMP22基因多種檢測方法研究進展
    參考文獻(xiàn)
致謝
已發(fā)表論文


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
[1]PMP22基因重復(fù)突變檢測及CMT1A相關(guān)臨床研究[D]. 段曉慧.中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué) 2009



本文編號：3660681