本文關(guān)鍵詞：硫酸軟骨素二糖誘導(dǎo)的miRNAs在多發(fā)性硬化動(dòng)物模型中的功能研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景:多發(fā)性硬化癥(Multiple Sclerosis,MS)是一種多發(fā)于青壯年時(shí)期損傷中樞神經(jīng)系統(tǒng)的自身免疫性疾病,其發(fā)病機(jī)制仍不清楚。目前普遍認(rèn)為,MS的發(fā)病原因是自身免疫性T細(xì)胞穿過血腦屏障,引起了神經(jīng)軸突脫髓鞘。并且已有的研究指出,硫酸軟骨素二糖是硫酸軟骨素糖蛋白的二糖降解產(chǎn)物,具有促進(jìn)神經(jīng)損傷修復(fù)的功能。因此,我們推測(cè)硫酸軟骨素二糖可能具有治療MS的功能。微小RNA(microRNAs,miRNAs)是一類長(zhǎng)度約為22bp左右,進(jìn)化上高度保守的非編碼RNA,其介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控是表觀遺傳學(xué)修飾的重要機(jī)制之一。研究發(fā)現(xiàn)miRNAs能夠通過靶向調(diào)節(jié)mRNA的降解或抑制mRNA翻譯來調(diào)控其轉(zhuǎn)錄。最近大量的研究表明,miRNAs參與了MS發(fā)生、發(fā)展變化的內(nèi)在機(jī)理,在MS患者的病灶處、體液、血清、血漿以及外周血細(xì)胞中多種miRNA均出現(xiàn)表達(dá)異常。還有研究證實(shí),這些miRNA可以在靶向改造(敲除、敲入)自身免疫性T細(xì)胞模型中調(diào)節(jié)自身免疫性T細(xì)胞的激活基因,從而成為基因治療MS的新靶點(diǎn)。所以,miRNAs可能在MS的發(fā)生和發(fā)展以及治療的過程中起著重要作用。目的:本課題擬探討硫酸軟骨素二糖及其誘導(dǎo)的miRNAs對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞CD44表達(dá)、淋巴細(xì)胞遷移以及對(duì)多發(fā)性硬化癥小鼠模型-實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)發(fā)生發(fā)展的作用及機(jī)制。方法:1.觀察硫酸軟骨素二糖對(duì)MOG多肽和百日咳毒素(Pertussiu Toxin,PTX)誘導(dǎo)的EAE小鼠細(xì)胞免疫學(xué)水平變化(淋巴細(xì)胞,浸潤性細(xì)胞,IFN-γ細(xì)胞因子變化)以及分子生物學(xué)水平變化(CD44,mi R-29b,miR-199b,IL-17,FOXP3)。2.通過計(jì)算機(jī)模擬程序研究mi R-29b和miR-199b與CD44 mRNAs 3'非編碼區(qū)序列的相互作用。3.通過電轉(zhuǎn)化用miR-29b和miR-199b的類似物和拮抗劑感染小鼠脾臟淋巴細(xì)胞,通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)miR-29b和miR-199b對(duì)CD44表達(dá)的影響。4.將miR-29b和miR-199b類似物和拮抗劑電轉(zhuǎn)化至EAE小鼠脾臟淋巴細(xì)胞,培養(yǎng)48小時(shí)后靜脈注射過繼免疫小鼠,14天后通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)淋巴細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的變化。結(jié)果:硫酸軟骨素二糖能夠抑制EAE的發(fā)生。EAE小鼠與對(duì)照組小鼠比較,體內(nèi)CD44表達(dá)增高且miR-29b,miR-199b表達(dá)降低。EAE小鼠經(jīng)硫酸軟骨素二糖處理后EAE小鼠體內(nèi)CD44的表達(dá)明顯降低,而miR-29b和miR-199b的表達(dá)增高。體外電轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)表明,miR-29b和miR-199b能夠抑制淋巴細(xì)胞內(nèi)CD44的表達(dá)同時(shí)能夠抑制淋巴細(xì)胞的增殖。通過將mi R-29b和miR-199b感染后的EAE小鼠脾臟淋巴細(xì)胞過繼免疫正常小鼠發(fā)現(xiàn),miR-29b和miR-199b能夠降低EAE小鼠體內(nèi)IL-17的表達(dá)。從而可能抑制EAE的發(fā)生和發(fā)展。結(jié)論:硫酸軟骨素二糖可以上調(diào)mi R-29b和miR-199b的表達(dá),并能抑制小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎的發(fā)生發(fā)展。通過計(jì)算機(jī)模擬程序,我們發(fā)現(xiàn)miR-29b和miR-199b均可和CD44 mRNAs 3'非編碼區(qū)序列結(jié)合。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明miR-29b和miR-199b能夠抑制CD44的表達(dá),因此,可能抑制淋巴細(xì)胞的增殖和遷移,從而抑制EAE的發(fā)生發(fā)展。同時(shí)miR-29b和miR-199b能夠調(diào)節(jié)EAE小鼠淋巴細(xì)胞內(nèi)IL-17的表達(dá),從而控制EAE的發(fā)展。
【關(guān)鍵詞】：多發(fā)性硬化癥 硫酸軟骨素二糖 實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎 CD44 miRNA
【學(xué)位授予單位】：魯東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R744.51;R-332
【目錄】：

• 致謝5-7
• 摘要7-9
• Abstract9-14
• 第1章 前言14-18
• 1.1 研究背景14-17
• 1.2 研究目的17
• 1.3 總結(jié)17-18
• 第2章 MicroRNAs在多發(fā)性硬化癥中的表達(dá)調(diào)控及其功能18-25
• 2.1 miRNAs在外周血和血漿中表達(dá)異常18-19
• 2.2 miRNAs在血液和外周血單核細(xì)胞中表達(dá)失調(diào)19
• 2.3 miRNAs在B細(xì)胞和單核細(xì)胞中表達(dá)異常19-20
• 2.4 miRNAs在大腦中表達(dá)異常20
• 2.5 miRNAs在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）中表達(dá)異常20
• 2.6 MS病人中miRNA異常表達(dá)的顯著特征20-21
• 2.7 miRNAs在MS中的調(diào)控21-22
• 2.8 miRNAs在MS中的功能22-23
• 2.9 miRNAs作為MS的診斷標(biāo)記23
• 2.10 miRNAs作為MS的治療靶點(diǎn)23-25
• 第3章 材料和方法25-35
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料25
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物25
• 3.1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器25
• 3.1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑25
• 3.1.4 引物序列25
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法25-35
• 3.2.1 小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的體外培養(yǎng)25-26
• 3.2.2 EAE模型的誘導(dǎo)26-28
• 3.2.3 RNA提取28
• 3.2.4 逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)28-30
• 3.2.5 Real-time PCR檢測(cè)30-31
• 3.2.6 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)細(xì)胞上清中IFN-γ 的含量31-32
• 3.2.7 RNA干擾32
• 3.2.8 MTT法檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖率32-33
• 3.2.9 小鼠的過繼免疫33
• 3.2.10 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)33-34
• 3.2.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理34-35
• 第4章 結(jié)果與分析35-52
• 4.1 硫酸軟骨素二糖抑制EAE的發(fā)生35-44
• 4.1.1 硫酸軟骨素和硫酸軟骨素二糖影響小鼠淋巴細(xì)胞的量35
• 4.1.1.1 脾臟淋巴細(xì)胞的變化35
• 4.1.1.2 血液淋巴細(xì)胞的變化35
• 4.1.2 硫酸軟骨素和硫酸軟骨素二糖在體外影響小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的增殖35-36
• 4.1.3 硫酸軟骨素和硫酸軟骨素二糖影響經(jīng)MOG刺激后脾細(xì)胞的增殖36-37
• 4.1.4 MOG多肽誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎模型的建立37-38
• 4.1.4.1 體重的變化37
• 4.1.4.2 神經(jīng)功能評(píng)分的變化37-38
• 4.1.5 硫酸軟骨素二糖影響EAE小鼠體內(nèi)淋巴細(xì)胞38-40
• 4.1.5.1 硫酸軟骨素二糖對(duì)EAE小鼠血細(xì)胞的影響38
• 4.1.5.2 硫酸軟骨素二糖抑制EAE小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的增殖38-39
• 4.1.5.3 硫酸軟骨素二糖降低EAE小鼠腦和脊髓浸潤性淋巴細(xì)胞的量39-40
• 4.1.6 硫酸軟骨素和硫酸軟骨素二糖對(duì)EAE小鼠脾細(xì)胞體外培養(yǎng)的作用40
• 4.1.7 硫酸軟骨素二糖對(duì)EAE小鼠腦浸潤性細(xì)胞中micro RNAs表達(dá)的影響40-42
• 4.1.7.1 硫酸軟骨素二糖上調(diào)EAE小鼠腦浸潤細(xì)胞內(nèi)miR-29b的表達(dá)41
• 4.1.7.2 硫酸軟骨素二糖上調(diào)EAE小鼠腦浸潤細(xì)胞內(nèi)miR-199b的表達(dá)41-42
• 4.1.8 硫酸軟骨素二糖和硫酸軟骨素對(duì)脾臟淋巴細(xì)胞基因表達(dá)的影響42
• 4.1.9 硫酸軟骨素二糖影響EAE小鼠基因表達(dá)的42-44
• 4.1.9.1 硫酸軟骨素二糖上調(diào)EAE小鼠脾細(xì)胞中FOXP3的表達(dá)42
• 4.1.9.2 硫酸軟骨素二糖下調(diào)EAE小鼠脾細(xì)胞中IFN-γ 的表達(dá)42-43
• 4.1.9.3 硫酸軟骨素二糖下調(diào)EAE小鼠脾細(xì)胞中IL-17 的表達(dá)43
• 4.1.9.4 硫酸軟骨素二糖下調(diào)EAE小鼠腦浸潤細(xì)胞內(nèi)CD44的表達(dá)43-44
• 4.1.10 硫酸軟骨素二糖對(duì)細(xì)胞因子IFN-γ 表達(dá)的影響44
• 4.2 miR-29b和miR-199b抑制EAE的發(fā)生44-52
• 4.2.1 通過計(jì)算機(jī)程序預(yù)測(cè)CD44的靶點(diǎn)miRNAs44-45
• 4.2.2 miR-29b和miR-199b抑制脾臟淋巴細(xì)胞CD44表達(dá)45-46
• 4.2.2.1 miR-29b類似物和miR-199b類似物抑制脾臟淋巴細(xì)胞細(xì)胞CD44表達(dá)45
• 4.2.2.2 miR-29b拮抗劑和miR-199b拮抗劑促進(jìn)脾臟淋巴細(xì)胞細(xì)胞CD44表達(dá)45-46
• 4.2.3 miR-29b拮抗劑和miR-199b拮抗劑促進(jìn)脾臟淋巴細(xì)胞細(xì)胞的增殖46-47
• 4.2.4 miR-29b和miR-199b對(duì)CD44表達(dá)的影響47-48
• 4.2.4.1 miR-29b類似物和miR-199b類似物對(duì)脾臟淋巴細(xì)胞CD44表達(dá)的影響47
• 4.2.4.2 miR-29b拮抗劑和miR-199b拮抗劑對(duì)脾臟淋巴細(xì)胞CD44表達(dá)的影響47-48
• 4.2.5 miR-29b對(duì)EAE的影響48-49
• 4.2.5.1 miR-29b作用后EAE小鼠的體重變化48
• 4.2.5.2 miR-29b作用后EAE小鼠的神經(jīng)功能評(píng)分48
• 4.2.5.3 miR-29b作用后EAE小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的變化48-49
• 4.2.6 miR-199b對(duì)EAE表達(dá)的影響49-52
• 4.2.6.1 miR-199b作用后EAE小鼠的體重變化49-50
• 4.2.6.2 miR-199b作用后EAE小鼠的神經(jīng)功能評(píng)分50
• 4.2.6.3 miR-199b作用后EAE小鼠的CD4+T細(xì)胞的變化50-52
• 第5章 討論52-54
• 5.1 硫酸軟骨素二糖抑制EAE的發(fā)生52-53
• 5.2 miR-29b和miR-199b抑制EAE的發(fā)生53-54
• 小結(jié)54-55
• 參考文獻(xiàn)55-61
• 附錄A 中英文縮略詞61-62
• 附錄B 實(shí)驗(yàn)儀器62-63
• 附錄C 實(shí)驗(yàn)試劑63-64
• 附錄D 常用緩沖液及試劑的配置64-65
• 附錄E ELISA檢測(cè)方法65-66
• 附錄F RNA提取方法66-67
• 附錄G 瓊脂糖凝膠電泳67-68
• 作者簡(jiǎn)歷68

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