皮層癲癇是常見的癲癇發(fā)作類型,容易發(fā)展為難治性癲癇,臨床治療預(yù)后較差。傳統(tǒng)針對神經(jīng)元的治療干預(yù)方法往往存在效率低和副作用大的缺點,因此需要尋找更加安全有效的治療方式及藥物靶點。近年來研究顯示星形膠質(zhì)細胞可能參與了癲癇發(fā)病機制。腦內(nèi)星形膠質(zhì)細胞介導的膠質(zhì)遞質(zhì)、離子和水的紊亂,及其介導的突觸可塑性和免疫反應(yīng)均可能參與癲癇發(fā)作。但是由于星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元有很多共同的作用靶點而一直無法實現(xiàn)特異性地調(diào)控,并且星形膠質(zhì)細胞在癲癇發(fā)作中的因果關(guān)系依舊不清楚。因此,本文利用光遺傳學技術(shù)特異性調(diào)控皮層星形膠質(zhì)細胞,明確其在癲癇發(fā)病中的作用,并探討調(diào)控星形膠質(zhì)細胞是否可以作為一種安全有效的策略用于防治皮層癲癇。首先,本文通過Cre-Loxp轉(zhuǎn)基因方式將光敏感蛋白ChR2特異性地表達到運動皮層區(qū)的星形膠質(zhì)細胞中,并使用藍光刺激表達ChR2的星形膠質(zhì)細胞方式來達到光遺傳學特異性調(diào)控的目的。研究發(fā)現(xiàn),藍光刺激表達ChR2的星形膠質(zhì)細胞能夠顯著抑制海人酸誘導的皮層癲癇發(fā)作,明顯延長癲癇發(fā)作的起始和全身性發(fā)作的潛時,降低最高發(fā)作等級和全身性發(fā)作次數(shù),這種抗癲癇作用不存在光照頻率的依賴性。在皮層癲癇的發(fā)作早期和發(fā)作... 

【文章來源】：浙江大學浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學位級別】：博士

【部分圖文】：

圖４光遺傳學特異性刺激表達ＣｈＲ２的皮層星形膠質(zhì)細胞減輕匹羅卡品誘導的皮??層癲癇的嚴重程度??

是神經(jīng)元的異常同步化放電，我們使用了在體單細胞記錄的方式，觀察藍光刺激??星形肢質(zhì)細胞是否影響皮層錐體神經(jīng)元的發(fā)放。我們首先記錄了不誘導癲癇的正??常狀態(tài)下星形肢質(zhì)細胞對神經(jīng)元的調(diào)控作用（圖５Ａ）。將已被鳥拉坦麻醉的??（７尺４Ｐ－Ｃ／２ｉ？２小鼠固定于立體定位儀上，通過液壓油泵將微電極緩慢下移到小鼠同??側(cè)Ｍｌ記錄錐體神經(jīng)元的發(fā)放頻率，將符合最大半波寬大于２００?ｎｓ并且自相關(guān)分??析呈凸型的神經(jīng)元認為是錐體神經(jīng)元（圖５Ｂ）。在Ｍｌ記錄到穩(wěn)定發(fā)放的錐體神??經(jīng)元后，給予２０?Ｈｚ，?１０?ｍｓ，１０?ｓ?ｏｎ／ｏｆｆ的藍光刺激。實驗結(jié)果顯示，藍光刺激星??形膠質(zhì)細胞后錐體神經(jīng)元的放電呈現(xiàn)異質(zhì)性：表現(xiàn)為一部分激活，一部分抑制或??是無反應(yīng)（圖５Ｃ）。通過進一步分析，我們發(fā)現(xiàn)對于發(fā)放頻率為０－１?Ｈｚ的低頻率??錐體神經(jīng)元，藍光刺激下有１１／３４是可以被抑制，１０／３４是被激活，還有１３／３４則??是無反應(yīng)。而對于發(fā)放頻率為１－５?Ｈｚ的錐體神經(jīng)元，藍光刺激時下神經(jīng)元有１７／３２??被抑制

在給予黃光刺激時才有作用，并沒有表現(xiàn)出早期調(diào)控星形膠質(zhì)細胞時的長時程作??用。然后，我們將在ＫＡ狀態(tài)下調(diào)控星形肢質(zhì)細胞和神經(jīng)元９０?ｍｉｎ后均撤掉光照，??比較到達ＧＳ的潛時（圖９Ａ）。從實驗結(jié)果來看，抑制神經(jīng)元組在撤掉光照１４．０６??±５．５６８?ｍｉｎ會到達ＧＳ，而調(diào)控星形膠質(zhì)細胞組則需要６３．８３±１９．３３?ｍｉｎ才到達??ＧＳ，進一步說明藍光刺激星形膠質(zhì)細胞時有長時程的抗癲癇作用而黃光抑制錐體??神經(jīng)元則沒有這種作用（圖９Ｂ）。有意思的是，如果只在癲癇后期黃光抑制神經(jīng)??元則完全不存在抗癲癇作用，提示光遺傳學直接抑制錐體神經(jīng)元所起的抗癲癇作??用的時間窗較窄。??２３??


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