本文關(guān)鍵詞：mTOR信號(hào)通路通過CD44促進(jìn)損傷類神經(jīng)元突起生長(zhǎng)的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：中樞神經(jīng)損傷后,由于缺血、缺氧和炎癥反應(yīng)引起神經(jīng)元死亡,神經(jīng)元胞體、軸索和髓鞘發(fā)生凋亡、變性、壞死。由于神經(jīng)元再生能力低下,一旦損傷,軸突很難再生,而軸突生長(zhǎng)是神經(jīng)損傷后再生的標(biāo)志。幾十年來科學(xué)家都在致力于尋找神經(jīng)損傷后軸突再生障礙的因素以及如何促進(jìn)軸突再生。越來越多的證據(jù)表明,神經(jīng)元再生能力是決定再生成敗不可缺少的關(guān)鍵因素。研究證實(shí),mTOR信號(hào)通路的活性是影響成熟神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)能力的關(guān)鍵因素,mTOR活性的不足是中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突再生障礙的主要原因,P13K/Akt/mTOR通路是調(diào)節(jié)神經(jīng)元再生能力的重要信號(hào)通路,但其作用機(jī)制尚不清楚。為此,本研究利用人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y)作為體外神經(jīng)細(xì)胞模型,通過誘導(dǎo)其分化為具有成熟神經(jīng)元特性的細(xì)胞,使其在形態(tài)、生理功能與正常神經(jīng)細(xì)胞相似。通過H_2O_2誘導(dǎo)其氧化應(yīng)激損傷建立類神經(jīng)元細(xì)胞損傷模型,利用siRNA沉默PTEN基因從而激活mTOR通路,應(yīng)用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)闡明mTOR信號(hào)通路通過CD44增強(qiáng)神經(jīng)元生長(zhǎng)能力,參與神經(jīng)損傷后軸突生長(zhǎng)錐的生成,進(jìn)而促進(jìn)損傷軸突的再生。方法:首先通過10μM全反式維甲酸(All-trans retinoic acid,ATRA)對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞誘導(dǎo)促進(jìn)其向神經(jīng)元方向分化。利用MTT方法確定H_2O_2的濃度,建立神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型,在氧化損傷的基礎(chǔ)上我們利用PTEN特異性siRNA對(duì)PTEN進(jìn)行干擾。我們分別設(shè)立:誘導(dǎo)對(duì)照組、H_2O_2組、H_2O_2+NC、H_2O_2+PTEN-RNAi組。利用熒光顯微鏡觀察各組熒光強(qiáng)度確認(rèn)轉(zhuǎn)染效率;利用RT-PCR的方法檢測(cè)PTEN mRNA的轉(zhuǎn)錄水平,Western blot方法檢測(cè)雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、磷酸化核糖體(p S6k)的蛋白表達(dá)水平;同時(shí)利用RT-PCR和Western blot的方法分別檢測(cè)CD44 mRNA、CD44蛋白的表達(dá)情況;并利用Phalloidin(鬼筆環(huán)肽)熒光特異性標(biāo)記肌動(dòng)蛋白(F-actin)觀察各組細(xì)胞生長(zhǎng)錐和突起的變化。利用共同干擾的方法同時(shí)沉默PTEN、CD44,觀察共同干擾組細(xì)胞生長(zhǎng)錐和突起的變化。結(jié)果:10μM ATRA誘導(dǎo)SH-SY5Y 72 h與未誘導(dǎo)組相比細(xì)胞突起明顯增長(zhǎng)、分化程度增強(qiáng)。當(dāng)H_2O_2濃度為50μM、100μM作用細(xì)胞24h時(shí)細(xì)胞在形態(tài)和存活率和對(duì)照組相比幾乎沒有變化,當(dāng)H_2O_2濃度為200μM作用24h時(shí),我們發(fā)現(xiàn)H_2O_2可以誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)、存活率的改變:與對(duì)照組相比H_2O_2誘導(dǎo)組細(xì)胞出現(xiàn)皺縮,胞質(zhì)折光性差,邊界模糊,突起縮短,部分細(xì)胞出現(xiàn)死亡,同時(shí)MTT結(jié)果顯示細(xì)胞存活率為74%。因此在實(shí)驗(yàn)中我們采用200μM H_2O_2處理SY5Y細(xì)胞24h為理想模型條件,成功構(gòu)建細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型。誘導(dǎo)細(xì)胞在氧化損傷的基礎(chǔ)上我們對(duì)PTEN基因特異性干擾,結(jié)果顯示:與誘導(dǎo)對(duì)照組、H_2O_2組、H_2O_2+NC組相比,PTEN干擾組PTEN mRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯下調(diào),差異顯著(P0.01),mTOR、p S6k蛋白表達(dá)水平明顯升高,差異顯著(P0.05);PTEN干擾組CD44 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平、CD44蛋白表達(dá)水平與未干擾組相比明顯上調(diào),差異顯著(P0.05)。對(duì)各組細(xì)胞每個(gè)生長(zhǎng)錐絲狀偽足數(shù)目及細(xì)胞突起長(zhǎng)度測(cè)量統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示:對(duì)照誘導(dǎo)組細(xì)胞突起較多且長(zhǎng),生長(zhǎng)錐較多,呈片狀和絲狀;H_2O_2損傷組細(xì)胞及H_2O_2+NC組細(xì)胞突起收縮變短,末端的生長(zhǎng)錐收縮成球狀,絲狀偽足數(shù)目與誘導(dǎo)對(duì)照組相比明顯減少,差異顯著(P0.05),突起長(zhǎng)度也明顯比誘導(dǎo)對(duì)照組短,差異顯著(P0.05);H_2O_2+PTEN-RNAi組細(xì)胞突起與H_2O_2損傷組和H_2O_2+NC組相比生長(zhǎng)錐多分成叉狀、突起末端球狀的生長(zhǎng)錐有絲狀偽足的生長(zhǎng),絲狀偽足的數(shù)量明顯增加(P0.05),突起明顯增長(zhǎng)(P0.05)。共同沉默PTEN、CD44的結(jié)果顯示:共同干擾組與對(duì)照組相比PTEN mRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯下調(diào)(P0.01),mTOR、p S6k蛋白表達(dá)水平明顯升高(P0.05);CD44 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平、CD44蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)(P0.05);細(xì)胞生長(zhǎng)錐多呈球狀或者棒狀,絲狀偽足數(shù)目明顯少于PTEN單獨(dú)干擾組(P0.05),突起長(zhǎng)度也明顯短于PTEN單獨(dú)干擾組(P0.05)。結(jié)論:PTEN抑制可以激活mTOR通路,mTOR通路激活后通過CD44分子表達(dá)上調(diào),促進(jìn)氧化應(yīng)激損傷后類神經(jīng)元生長(zhǎng)錐生長(zhǎng)進(jìn)而促進(jìn)突起的生長(zhǎng)。
【關(guān)鍵詞】：中樞神經(jīng)損傷 氧化應(yīng)激 mTOR信號(hào)通路 CD44生長(zhǎng)錐 突起生長(zhǎng)
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R741
【目錄】：

• 前言4-5
• 摘要5-7
• Abstract7-13
• 第一章 文獻(xiàn)綜述13-23
• 1.1 神經(jīng)系統(tǒng)氧化應(yīng)激損傷的研究現(xiàn)狀13-14
• 1.2 中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)的研究進(jìn)展14-20
• 1.2.1 改善微環(huán)境促進(jìn)軸突再生14-17
• 1.2.2 神經(jīng)干細(xì)胞移植17
• 1.2.3 增加神經(jīng)元再生能力可以更有效的促進(jìn)損傷神經(jīng)元的軸突再生17-20
• 1.3 新的生長(zhǎng)錐的生成是軸突損傷后再生的必要條件20-23
• 第二章 材料與方法23-36
• 2.1 實(shí)驗(yàn)儀器23-24
• 2.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞24
• 2.3 實(shí)驗(yàn)試劑24-26
• 2.4 實(shí)驗(yàn)試劑的配制26-27
• 2.5 實(shí)驗(yàn)方法27-36
• 2.5.1 SH-SY5Y細(xì)胞的培養(yǎng)27-29
• 2.5.2 MTT實(shí)驗(yàn)確定過氧化氫濃度建立氧化損傷細(xì)胞模型29-30
• 2.5.3 RNA干擾技術(shù)30
• 2.5.4 RT-PCR技術(shù)檢測(cè)PTEN干擾后PTEN、CD44基因轉(zhuǎn)錄水平30-32
• 2.5.5 Western blot技術(shù)檢測(cè)PTEN干擾后mTOR、Ps6k、CD44蛋白翻譯水平32-34
• 2.5.6 Phalloidin熒光標(biāo)記F-actin34
• 2.5.7 PTEN和CD44共同干擾技術(shù)34-35
• 2.5.8 圖像分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理35-36
• 第三章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析36-51
• 3.1 10 μM ATRA誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞分化36
• 3.2 誘導(dǎo)細(xì)胞分化程度的鑒定36
• 3.3 SH-SY5Y細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷細(xì)胞模型的建立36-38
• 3.4 利用RNA干擾技術(shù)使PTEN表達(dá)下調(diào)并檢測(cè)其轉(zhuǎn)錄水平38-39
• 3.5 PTEN基因下調(diào)后Western blot技術(shù)檢測(cè)mTOR、pS6k蛋白表達(dá)水平39-41
• 3.6 mTOR通路激活對(duì)氧化損傷細(xì)胞生長(zhǎng)錐和突起長(zhǎng)度的影響41-43
• 3.7 檢測(cè)實(shí)驗(yàn)各組CD44的表達(dá)43-44
• 3.8 PTEN和CD44共同干擾實(shí)驗(yàn)44-51
• 3.8.1 CD44 siRNA干擾效率的確定44-45
• 3.8.2 PTEN和CD44共同干擾后CD44和PTEN表達(dá)水平檢測(cè)45-48
• 3.8.3 PTEN和CD44共同干擾后實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞生長(zhǎng)錐和突起的生長(zhǎng)情況48-51
• 第四章 討論51-54
• 第五章 結(jié)論54-55
• 參考文獻(xiàn)55-63
• 研究生期間取得的科研成果63-64
• 作者簡(jiǎn)介63
• 發(fā)表論文63-64
• 致謝64

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本文編號(hào)：357462