本文關(guān)鍵詞：Pur α蛋白在癲癇所致DNA損傷與修復(fù)中作用的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的研究Purα蛋白通過慢病毒載體對匹羅卡品誘導(dǎo)癲癇大鼠所致DNA損傷的保護作用,以及Purα蛋白在DNA損傷修復(fù)中的作用。材料和方法實驗動物選擇經(jīng)過寧夏醫(yī)科大學(xué)的倫理委員會審查批準,按照相關(guān)的動物實驗操作準則進行試驗。實驗動物均選擇雄性Sparague-Dawley(SD)大鼠。條件為:清潔級成年大鼠,6~8周,體重在220~250g之間。飼養(yǎng)條件:避光,適宜的溫度和濕度24小時晝夜循環(huán),安靜,單籠,免費的食物和水平衡飼養(yǎng)條件下1周,以消除對環(huán)境的影響。60只SD大鼠隨機分為Purα過表達組、PurαSi RNA組、空載體組及空白對照組共四組,每組15只。隨機選取SD實驗大鼠,以按照40mg/kg體重給藥劑量腹腔注射1%的戊巴比妥鈉溶液。然后參照Pacino’s等的大鼠腦立體定位圖譜,確定左側(cè)海馬CA1區(qū)(坐標:前囟后3.7mm,旁開1.2mm,深度3.6mm),用微量注射器緩慢推注3μL慢病毒懸液(5×108TU病毒顆粒)。對照組按上述同樣方法和坐標,注射等體積的生理鹽水以完成手術(shù)操作。手術(shù)完畢將其放回籠內(nèi)單籠飼養(yǎng);術(shù)后連續(xù)3天腹腔注射青霉素5萬U/d預(yù)防感染。注射病毒二周后每組隨機選取6只大鼠斷頭取腦,剝離出海馬組織,通過熒光切片和Western Blotting證實Purα慢病毒已經(jīng)在海馬組織表達;其余每組大鼠用匹羅卡品誘導(dǎo)癲癇;根據(jù)由孫濤教授主編《島葉癲癇》大鼠癲癇發(fā)作分級及Racine評分標準為依據(jù)來判定癲癇發(fā)作級別,若癲癇發(fā)作達到Ⅲ~Ⅴ級則視為成功。若癲癇未發(fā)作或發(fā)作沒有達到Ⅲ級則按要求每30min增加注射一次匹羅卡品,增加劑量為10mg/kg,補充的總注射次數(shù)最多不超過4次。癲癇發(fā)作1小時后觀察記錄大鼠的行為學(xué)變化并進行實驗取材。一部分SD大鼠斷頭玻璃腦組織取海馬CAI區(qū)組織進行凍存;一部分SD實驗大鼠行活體灌注取材石蠟包埋;取材進行免疫組織化學(xué)檢測γH2AX表達水平;通過Western-Blot檢測Purα,Parp-1,Ku80和XRCC4的表達變化水平。統(tǒng)計分析使用SPSS20.0軟件比較分析,所得實驗的數(shù)據(jù)以X士S來表示。采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)數(shù)據(jù)統(tǒng)計比較,多組間的比較采用LSD法進行均數(shù)間的兩兩比較,當各組的方差不齊時用Dunnett法進行均數(shù)間的兩兩比較。實驗結(jié)果以P0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。實驗結(jié)果1.得出的行為學(xué)結(jié)果:進行癲癇誘導(dǎo)后大鼠開始表現(xiàn)為持續(xù)性的抖動、間斷的面肌抽搐、咀嚼,隨后出現(xiàn)濕狗樣抽動、雙側(cè)前肢打轉(zhuǎn)后跌倒,癥狀明顯者,可出現(xiàn)反復(fù)性的旋轉(zhuǎn)。2.冰凍切片:海馬CA1區(qū)注射高滴度的Purα慢病毒顆粒2周后,在熒光顯微鏡下,可見海馬組織呈現(xiàn)大量的被病毒感染的帶有熒光的細胞出現(xiàn),說明慢病毒感染是成功的。3.免疫組織化學(xué):在匹羅卡品誘導(dǎo)大鼠癲癇發(fā)作1小時后,大鼠海馬組織中可見DNA損傷的標志性蛋白γH2AX的表達增高。在各組植入慢病毒二周行匹羅卡品誘導(dǎo)癲癇后,Purα過表達組的γH2AX陽性染色細胞數(shù)目要遠遠低于空載組和誘導(dǎo)癲癇組(p0.01);而Purα沉默組的γH2AX陽性染色細胞的數(shù)目則遠遠高于空載組和對照組(p0.01),二者之間有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義;而空載組與對照組相比則沒有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05),說明Purα對癲癇發(fā)作所導(dǎo)致的DNA損傷有保護作用,沉默Purα基因的表達,可使得癲癇誘導(dǎo)的DNA損傷加重。4.Western-Blot:Parp-1,Ku80和XRCC4的表達水平,與對照組和空載組比較,在Purα沉默組有著非常明顯的增高,而在Purα過表達組則明顯降低,二者之間有著顯著性的差異(p0.01)。對照組與空載組則未見明顯的差異(p0.05)(見圖6-7)。說明Purα對癲癇所誘導(dǎo)的DNA損傷有保護作用。結(jié)論匹羅卡品致癇大鼠早期可引起海馬組織中的DNA損傷,Purα對癲癇所誘導(dǎo)的DNA損傷有保護作用。
【關(guān)鍵詞】：癲癇 人轉(zhuǎn)錄因子活性蛋白α 匹羅卡品
【學(xué)位授予單位】：寧夏醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R742.1
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-9
• 中英文縮略詞表9-11
• 前言11-13
• 材料和方法13-27
• 結(jié)果27-34
• 討論34-38
• 結(jié)論38-39
• 參考文獻39-43
• 綜述43-58
• 綜述參考文獻52-58
• 致謝58-59
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文59-60
• 個人簡歷60

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本文編號：355242