本文關(guān)鍵詞：鋰調(diào)控缺氧NSCs增殖的作用機(jī)制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的通過(guò)分離培養(yǎng)及鑒定新生SD乳鼠NSCs,建立缺氧NSCs模型,以氯化鋰作為干預(yù)措施,探討鋰是否通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)控缺氧NSCs增殖,為臨床應(yīng)用鋰治療HIBD提供更有力的實(shí)驗(yàn)和理論證據(jù)。方法1.NSCs分離、培養(yǎng)及鑒定:脫頸處死新生1天內(nèi)SD乳鼠,75%酒精浸泡消毒,分離海馬組織,剔除腦膜及血管,平衡鹽溶液沖洗,剪碎海馬組織,0.25%胰酶消化后離心,重懸細(xì)胞后按5×105/ml的密度接種于含無(wú)血清培養(yǎng)基的25ml培養(yǎng)瓶中,37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng),2-3天半量換液一次,5-7天傳代,得到NSCs。將部分傳代NSCs按5×105/ml的密度接種于含新生小牛血清培養(yǎng)基,置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。采用免疫組織化學(xué)技術(shù)鑒定NSCs及其增殖分化功能。2.建立缺氧NSCs模型:將傳代培養(yǎng)的NSCs按5×105活細(xì)胞/ml的密度移入無(wú)糖DMEM培養(yǎng)基中,放入通入5%CO2和95%N2混合氣體的缺氧盒,37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。以通氣體時(shí)間30分鐘、1小時(shí)及2小時(shí)為檢測(cè)時(shí)相點(diǎn),取出細(xì)胞在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、臺(tái)盼藍(lán)細(xì)胞計(jì)數(shù)和CCK-8法檢測(cè)NSCs活性,然后更換無(wú)血清培養(yǎng)基。以上三點(diǎn)與正常對(duì)照組存在差異,則表明缺氧NSCs模型制作成功。3.氯化鋰干預(yù)調(diào)控缺氧NSCs增殖機(jī)制:根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求,將傳代培養(yǎng)的NSCs分為正常對(duì)照組,單純?nèi)毖踅M,生理鹽水干預(yù)組,1m M、3m M、5m M氯化鋰干預(yù)組等6組;按5×105活細(xì)胞/ml密度接種至6個(gè)35mm培養(yǎng)皿中,其中,正常對(duì)照組加入無(wú)血清培養(yǎng)基;其余組加入無(wú)糖DMEM培養(yǎng)基后入自制缺氧盒,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。缺氧1小時(shí),取出缺氧后的NSCs顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、記數(shù),并迅速更換無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),單純?nèi)毖踅M僅缺氧,生理鹽水干預(yù)組缺氧后加生理鹽水,3組氯化鋰干預(yù)組分別加入氯化鋰至所需的濃度,放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天后檢測(cè)Akt/P-Akt、GSK-3b/P-GSK-3b、Caspase-9/P-Caspase-9。結(jié)果1.NSCs分離、培養(yǎng)及鑒定:新生SD乳鼠海馬分離的細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)1-2天,呈懸浮生長(zhǎng),細(xì)胞呈單個(gè)、成對(duì)或三個(gè)不等、折光性強(qiáng)、邊界清楚、呈亮圓形。培養(yǎng)3天后細(xì)胞增殖成發(fā)亮的圓球狀細(xì)胞團(tuán),大小不等。培養(yǎng)5-7天時(shí)神經(jīng)球逐漸增大,數(shù)量逐漸增多,形態(tài)規(guī)則,中央部發(fā)黃,折光性明顯降低,周圍無(wú)突起生長(zhǎng)。傳代培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)同原代,經(jīng)Nestin鑒定該細(xì)胞為NSCs,Brd U證實(shí)NSCs處于增殖狀態(tài);誘導(dǎo)NSCs分化后細(xì)胞邊緣產(chǎn)生大量突起,互相交織成網(wǎng),呈三角形、梭形等多種形狀,經(jīng)NSE及GFAP鑒定分化的細(xì)胞為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞。2.NSCs缺氧模型制作:在無(wú)糖DMEM培養(yǎng)基和缺氧盒中缺氧培養(yǎng)1小時(shí)后,NSCs形態(tài)不規(guī)則、數(shù)量減少、折光性減弱、胞體腫脹、甚至出現(xiàn)細(xì)胞膜破裂;缺氧組NSCs死亡數(shù)明顯增多、活性明顯降低(P均0.05),證明缺氧NSCs模型成功。3.氯化鋰調(diào)控缺氧NSCs增殖的機(jī)制:3m M氯化鋰干預(yù)組與單純?nèi)毖踅M、生理鹽水干預(yù)組、1m M氯化鋰干預(yù)組相比紅色熒光最強(qiáng),表明3m M氯化鋰干預(yù)組缺氧NSCs主要表達(dá)P-Akt、P-GSK-3β、P-Caspase-9標(biāo)記物;5m M氯化鋰干預(yù)組紅色熒光較3m M氯化鋰干預(yù)組減弱,綠色熒光增強(qiáng),表明該組細(xì)胞主要表達(dá)Akt、GSK-3β、Caspase-9標(biāo)記物。1m M、3m M氯化鋰干預(yù)組P-Akt/P-GSK-3b/P-Caspase-9陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較單純?nèi)毖踅M、生理鹽水干預(yù)組明顯增多(P0.05);與3m M氯化鋰干預(yù)組相比,5m M氯化鋰干預(yù)組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少(P0.05)。結(jié)論1.自制缺氧盒可以成功建立NSCs缺氧模型。2.1m M、3m M氯化鋰均能促進(jìn)缺氧NSCs增殖,但3m M氯化鋰促進(jìn)缺氧NSCs增殖的能力較1m M氯化鋰強(qiáng);5m M氯化鋰抑制缺氧NSCs增殖。3.1m M、3m M氯化鋰干預(yù)促進(jìn)缺氧NSCs增殖時(shí),Akt、Caspase-9及GSK-3?表達(dá)逐漸減弱,P-Akt、P-Caspase-9及P-GSK-3?表達(dá)逐漸增強(qiáng)。4.5m M氯化鋰干預(yù)抑制缺氧NSCs增殖時(shí),Akt、Caspase-9及GSK-3?表達(dá)逐漸增強(qiáng),P-Akt、P-Caspase-9及P-GSK-3?表達(dá)逐漸減弱。5.氯化鋰增加GSK-3?、Caspase-9酶活性與其劑量存在相關(guān)性。6.氯化鋰通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)控缺氧NSCs增殖。
【關(guān)鍵詞】：神經(jīng)干細(xì)胞 缺氧模型 信號(hào)通路 氯化鋰
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R742
【目錄】：

• 中英文名詞縮寫與對(duì)照5-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 1.前言13-15
• 2.材料與方法15-25
• 3.結(jié)果25-40
• 4.討論40-47
• 5.結(jié)論47
• 6.參考文獻(xiàn)47-55
• 附錄55-56
• 1、個(gè)人簡(jiǎn)歷55
• 2、在讀期間的研究成果目錄55-56
• 致謝56-57
• 綜述57-65
• 參考文獻(xiàn)62-65

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：鋰調(diào)控缺氧NSCs增殖的作用機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：354515