發(fā)布時(shí)間：2021-12-17 01:10

　　膽堿能神經(jīng)元（cholinergic neuron）是能合成乙酰膽堿并且以乙酰膽堿（Ach）為遞質(zhì)的神經(jīng)元,在體內(nèi)的分布非常廣泛。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的膽堿能神經(jīng)元與學(xué)習(xí)、記憶以及注意力密切相關(guān)。膽堿能神經(jīng)元的病變會(huì)引起阿爾茨海默癥等嚴(yán)重的神經(jīng)退化性疾病。獲得膽堿能神經(jīng)元特異標(biāo)記的細(xì)胞系,可以更好地了解膽堿能神經(jīng)元的分化、生理生化特性及引起阿爾茨海默癥等嚴(yán)重的神經(jīng)退化性疾病的病理機(jī)制。然而,已有的能夠特異性標(biāo)記膽堿能神經(jīng)元的細(xì)胞均為動(dòng)物來(lái)源,缺乏相應(yīng)的人來(lái)源的細(xì)胞系。為了獲得特異性標(biāo)記的膽堿能神經(jīng)元人源細(xì)胞系,本文利用最新的基因編輯技術(shù)—CRISPR（Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats）/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建了由膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶（Choline acetyltransferase,ChAT）基因內(nèi)源性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)zsGreen的膽堿能神經(jīng)元特異性標(biāo)記的人胚胎干細(xì)胞（human embryonic stem cell,hESC）。ChAT-zsGreen細(xì)胞系在ES階段時(shí)具有干性且無(wú)綠色熒光蛋白表達(dá),而當(dāng)其分化成膽堿能神... 

【文章來(lái)源】：南昌大學(xué)江西省 211工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：65 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第1章 前言
    1.1 膽堿能神經(jīng)元的研究
        1.1.1 膽堿能神經(jīng)元的功能
        1.1.2 與膽堿能神經(jīng)元相關(guān)的疾病
        1.1.3 膽堿能神經(jīng)元與睡眠相關(guān)方面
    1.2 CRISPR/Cas9技術(shù)的研究
        1.2.1 常用基因編輯技術(shù)
        1.2.3 CRISPR/Cas9的相關(guān)應(yīng)用
    1.3 Cre/LoxP與內(nèi)源性啟動(dòng)子模型的應(yīng)用
第2章 實(shí)驗(yàn)材料
    2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備和試劑耗材
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)主要設(shè)備及器材
        2.1.2 試劑耗材
    2.2 抗體信息
    2.3 引物信息
    2.4 質(zhì)粒信息
    2.5 細(xì)胞來(lái)源
第3章 實(shí)驗(yàn)方法
    3.1 ChAT基因序列信息獲得
    3.2 質(zhì)粒構(gòu)建
        3.2.1 同源重組質(zhì)粒的設(shè)計(jì)
        3.2.2 同源重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.2.3 Cas9質(zhì)粒的設(shè)計(jì)
        3.2.4 Cas9引導(dǎo)序列的獲得
        3.2.5 Cas9質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.2.6 感受態(tài)轉(zhuǎn)化
        3.2.7 菌落鑒定
    3.3 細(xì)胞準(zhǔn)備
        3.3.1 293ft細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)
        3.3.2 H9-ESC細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)
    3.4 T7酶切檢驗(yàn)Cas9質(zhì)粒的作用
        3.4.1 293FT的轉(zhuǎn)染
        3.4.2 T7酶切實(shí)驗(yàn)
    3.5 ChAT基因標(biāo)記的細(xì)胞系的篩選
        3.5.1 H9-ES細(xì)胞的電轉(zhuǎn)
        3.5.2 細(xì)胞系的藥物篩選
        3.5.3 細(xì)胞系的基因鑒定
    3.6 ES細(xì)胞向膽堿能神經(jīng)元的誘導(dǎo)分化
    3.7 免疫熒光染色
第4章 結(jié)果與分析
    4.1 同源重組與Cas9質(zhì)粒的驗(yàn)證
        4.1.1 同源重組質(zhì)粒的獲得
        4.1.2 Cas9質(zhì)粒的作用效果
    4.2 H9-ESC細(xì)胞系免疫組化鑒定
    4.3 ChAT基因標(biāo)記的ES細(xì)胞系的鑒定結(jié)果
        4.3.1 ChAT基因標(biāo)記的ES細(xì)胞系的PCR鑒定
        4.3.2 Ch AT 基因標(biāo)記的 ES 細(xì)胞系的測(cè)序鑒定
        4.3.3 ChAT基因標(biāo)記的ES細(xì)胞系的免疫染色鑒定
        4.3.4 ChAT基因標(biāo)記的ES細(xì)胞系的熒光表達(dá)情況
    4.4 ChAT基因標(biāo)記的ES細(xì)胞系向膽堿能神經(jīng)元的誘導(dǎo)分化
        4.4.1 ChAT基因標(biāo)記的ES向NSC分化
        4.4.2 ChAT-zsGreen NSC細(xì)胞的熒光表達(dá)情況
        4.4.3 NSC向膽堿能神經(jīng)元分化
第5章 討論
致謝
參考文獻(xiàn)



本文編號(hào)：3539134