第一部分貝沙羅汀通過PPARγ介導(dǎo)的途徑抑制SD大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后的血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的機(jī)制探究背景:血管平滑肌細(xì)胞在蛛網(wǎng)膜下腔出血后的中樞神經(jīng)系統(tǒng)病理生理過程中扮演著重要的角色。對于PPARγ介導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化在蛛網(wǎng)膜下腔出血中的影響,目前尚未明了。本研究主要探討了貝沙羅汀通過PPARγ介導(dǎo)的途徑對蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦動(dòng)脈的平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的影響作用以及潛在的神經(jīng)血管保護(hù)機(jī)制。方法:選取成年雄性Sprague-Dawley大鼠（SD鼠）,使用血管內(nèi)穿刺模型建立蛛網(wǎng)膜下腔出血模型。使用改良Garcia評分（modified Garcia score）用于評估大鼠神經(jīng)功能損傷情況。使用蛛網(wǎng)膜下腔出血分級（SAH grading）,死亡率和腦水含量（brain water content）用于評估蛛網(wǎng)膜下腔出血的嚴(yán)重程度。激光散斑（Laser speckle）用于測量大腦皮層血流量。使用免疫蛋白印跡（Western blot,WB）和免疫熒光（immunofluorescence）檢測血管平滑肌細(xì)胞表型（α-SMA和Smemb）的標(biāo)志物。使用WB和IF測量5-脂氧合酶活化蛋白... 

【文章來源】：重慶醫(yī)科大學(xué)重慶市

【文章頁數(shù)】：103 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

1血管內(nèi)穿刺的示意圖

圖 1.1.2 載體質(zhì)粒的示意圖Figure 1.1.2 Schematic diagram of vector plasmids.6.2 實(shí)驗(yàn)原理RNA 干擾（RNA interference，RNAi）是與靶基因序列同源的雙鏈 RNdouble-stranded RNA，dsRNA）所誘導(dǎo)的一種特異性基因沉默現(xiàn)象。RNAi 技使用可以特異性地減少或關(guān)閉特定基因的表達(dá)，因此該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于治療領(lǐng)域， 用于探索基因功能和傳染病以及惡性腫瘤。處理細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄hRNA 并將其摻入 RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RISC）中以指導(dǎo)核酸酶降解靶 RN毒 shRNA 載體也可用于 RNAi 干擾，具有抗生素標(biāo)記的載體可繼續(xù)抑制細(xì)胞基 因的表達(dá)數(shù)周或更長時(shí)間。與其他載體相比，病毒 shRNA 載體可以成功接感染 細(xì)胞進(jìn)行基因沉默，轉(zhuǎn)染效果穩(wěn)定，可以避免質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率低下造成便。實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簶?gòu)建帶有 EGFP 熒光標(biāo)記和目的序列的重組干擾載體。

架質(zhì)粒 pHBAd-BHG，并用 LipofiterTM 轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染。具體步驟為：2ug 重組腺病毒載體質(zhì)粒 h-SNCA，4ug 主鏈質(zhì)粒 pHBAd-BHG。用 300 μl 的 DMEM 培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋，室溫放置 5 min。b．取 15 ul 的 LipofiterTM，用 300 μl 的 DMEM 培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋，室溫放置 5min。c．將兩者混和，室溫避光放置 20 min。然后將混合物加入 60mm 培養(yǎng)皿中，用 8 個(gè)字搖動(dòng)，并置于 37℃含 5％CO2 的培養(yǎng)箱中。換液轉(zhuǎn)染病毒之后過 6 小時(shí)，將細(xì)胞培養(yǎng)液換為新鮮培養(yǎng)液。收毒（P1）：每天觀察細(xì)胞出毒跡象。出毒的現(xiàn)象是細(xì)胞變得更大，更圓，呈現(xiàn)葡萄狀，并開始出 現(xiàn)明顯的斑塊。大多數(shù)細(xì)胞留在病灶中并從底部脫落以進(jìn)行出毒。將60mm 培養(yǎng)皿中的所有細(xì)胞和培養(yǎng)物置于 15ml 離心管中。


本文編號：3524004