背景:肌肉萎縮是一種嚴(yán)重危害人類健康的疾病,目前尚無有效的治療措施。由肌肉干細胞介導(dǎo)的肌肉再生被認為是肌肉組織功能重建的重要途徑,配對盒7（Paired box 7,PAX7）是肌肉干細胞,即肌肉衛(wèi)星細胞的標(biāo)志基因,在衛(wèi)星細胞增殖和自我更新過程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。然而,PAX7參與衛(wèi)星細胞調(diào)控的分子機制尚不十分明確。我們前期研究發(fā)現(xiàn)MRTF-A在衛(wèi)星細胞中高表達,本研究在此基礎(chǔ)上,旨在探討MRTF-A調(diào)控PAX7的表達,進而影響肌肉細胞增殖和自我更新過程的分子機制,為肌肉萎縮的臨床防治提供新思路。方法:在小鼠組織中提取衛(wèi)星細胞并通過流式、免疫熒光等方法鑒定;利用慢病毒技術(shù)篩選穩(wěn)定過表達/敲降MRTF-A成肌細胞C2C12細胞系,通過RT-qPCR、Western blot檢測衛(wèi)星細胞及穩(wěn)定過表達/敲降MRTF-A的C2C12細胞系中MRTF-A和PAX7及下游增殖分化相關(guān)基因的表達情況;通過免疫熒光、MTT、EdU、流式細胞技術(shù)等實驗檢測過表達和敲降MRTF-A對小鼠成肌細胞的增殖、凋亡以及自我更新的影響;通過RT-qPCR和Western blot檢測在增殖和分化階段MRTF-A... 

【文章來源】：武漢科技大學(xué)湖北省

【文章頁數(shù)】：59 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第1章 前言
第2章 實驗材料
    2.1 實驗菌種與細胞株
    2.2 實驗組織樣品
    2.3 實驗儀器
    2.4 實驗試劑
第3章 實驗方法
    3.1 細胞培養(yǎng)
    3.2 衛(wèi)星細胞分離
    3.3 流式細胞技術(shù)
    3.4 RT-qPCR
    3.5 損傷模型的構(gòu)建
    3.6 H&E染色
    3.7 Western blot
    3.8 組織切片的免疫組化
    3.9 構(gòu)建重組載體
        3.9.1 構(gòu)建重組質(zhì)粒
        3.9.2 轉(zhuǎn)化
        3.9.3 質(zhì)粒小提
        3.9.4 質(zhì)粒中提
    3.10 慢病毒包裝
    3.11 EdU(5-乙炔基-2’-脫氧尿苷)細胞標(biāo)記測定
    3.12 CCK-8
    3.13 細胞免疫熒光
    3.14 熒光素酶活性
    3.15 EMSA
        3.15.1 核蛋白提取
        3.15.2 EMSA實驗
    3.16 ChIP
第4章 實驗結(jié)果
    4.1 研究MRTF-A和 PAX7 在肌肉細胞中的表達情況
        4.1.1 衛(wèi)星細胞的分離及鑒定
        4.1.2 檢測MRTF-A和 PAX7 在肌肉細胞增殖分化中的表達變化
    4.2 探究MRTF-A和 PAX7 在小鼠肌肉再生中的作用
        4.2.1 H&E染色檢測CTX損傷模型小鼠的肌肉再生情況
        4.2.2 RT-qPCR檢測MRTF-A和 PAX7 在肌肉再生過程中的表達
        4.2.3 Western blot和免疫組化檢測MRTF-A和 PAX7 在肌肉再生中的表達
    4.3 證明MRTF-A調(diào)控肌肉細胞的增殖和自我更新
        4.3.1 干擾/過表達MRTF-A穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系的篩選及驗證
        4.3.2 MRTF-A對肌肉細胞的增殖的影響
        4.3.3 MRTF-A對肌肉細胞的自我更新的影響
        4.3.4 MRTF-A對肌肉細胞的凋亡的影響
    4.4 證明MRTF-A通過影響PAX7 基因的表達進而參與肌肉再生
        4.4.1 檢測CTX損傷小鼠肌肉再生過程中相關(guān)基因的表達情況
        4.4.2 檢測干擾/過表達MRTF-A對 PAX7 及下游基因的影響
    4.5 證明MRTF-A對 PAX7 基因的調(diào)控依賴其啟動子區(qū)的CarG box元件
        4.5.1 PAX7 啟動子區(qū)截短以及定點突變報告載體的構(gòu)建
        4.5.2 雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測MRTF-A對 PAX7 啟動子報告基因活性的影響
        4.5.3 通過EMSA和 ChIP檢測MRTF-A對 PAX7 啟動子區(qū)CarG box的結(jié)合
第5章 結(jié)論
第6章 討論與展望
致謝
參考文獻
附錄1 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文
附錄2 攻讀碩士學(xué)位期間參加的科研項目



本文編號：3430475