背景:肌肉萎縮是一種嚴(yán)重危害人類健康的疾病,目前尚無(wú)有效的治療措施。由肌肉干細(xì)胞介導(dǎo)的肌肉再生被認(rèn)為是肌肉組織功能重建的重要途徑,配對(duì)盒7（Paired box 7,PAX7）是肌肉干細(xì)胞,即肌肉衛(wèi)星細(xì)胞的標(biāo)志基因,在衛(wèi)星細(xì)胞增殖和自我更新過(guò)程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。然而,PAX7參與衛(wèi)星細(xì)胞調(diào)控的分子機(jī)制尚不十分明確。我們前期研究發(fā)現(xiàn)MRTF-A在衛(wèi)星細(xì)胞中高表達(dá),本研究在此基礎(chǔ)上,旨在探討MRTF-A調(diào)控PAX7的表達(dá),進(jìn)而影響肌肉細(xì)胞增殖和自我更新過(guò)程的分子機(jī)制,為肌肉萎縮的臨床防治提供新思路。方法:在小鼠組織中提取衛(wèi)星細(xì)胞并通過(guò)流式、免疫熒光等方法鑒定;利用慢病毒技術(shù)篩選穩(wěn)定過(guò)表達(dá)/敲降MRTF-A成肌細(xì)胞C2C12細(xì)胞系,通過(guò)RT-qPCR、Western blot檢測(cè)衛(wèi)星細(xì)胞及穩(wěn)定過(guò)表達(dá)/敲降MRTF-A的C2C12細(xì)胞系中MRTF-A和PAX7及下游增殖分化相關(guān)基因的表達(dá)情況;通過(guò)免疫熒光、MTT、EdU、流式細(xì)胞技術(shù)等實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)和敲降MRTF-A對(duì)小鼠成肌細(xì)胞的增殖、凋亡以及自我更新的影響;通過(guò)RT-qPCR和Western blot檢測(cè)在增殖和分化階段MRTF-A... 

【文章來(lái)源】：武漢科技大學(xué)湖北省

【文章頁(yè)數(shù)】：59 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第1章 前言
第2章 實(shí)驗(yàn)材料
    2.1 實(shí)驗(yàn)菌種與細(xì)胞株
    2.2 實(shí)驗(yàn)組織樣品
    2.3 實(shí)驗(yàn)儀器
    2.4 實(shí)驗(yàn)試劑
第3章 實(shí)驗(yàn)方法
    3.1 細(xì)胞培養(yǎng)
    3.2 衛(wèi)星細(xì)胞分離
    3.3 流式細(xì)胞技術(shù)
    3.4 RT-qPCR
    3.5 損傷模型的構(gòu)建
    3.6 H&E染色
    3.7 Western blot
    3.8 組織切片的免疫組化
    3.9 構(gòu)建重組載體
        3.9.1 構(gòu)建重組質(zhì)粒
        3.9.2 轉(zhuǎn)化
        3.9.3 質(zhì)粒小提
        3.9.4 質(zhì)粒中提
    3.10 慢病毒包裝
    3.11 EdU(5-乙炔基-2’-脫氧尿苷)細(xì)胞標(biāo)記測(cè)定
    3.12 CCK-8
    3.13 細(xì)胞免疫熒光
    3.14 熒光素酶活性
    3.15 EMSA
        3.15.1 核蛋白提取
        3.15.2 EMSA實(shí)驗(yàn)
    3.16 ChIP
第4章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    4.1 研究MRTF-A和 PAX7 在肌肉細(xì)胞中的表達(dá)情況
        4.1.1 衛(wèi)星細(xì)胞的分離及鑒定
        4.1.2 檢測(cè)MRTF-A和 PAX7 在肌肉細(xì)胞增殖分化中的表達(dá)變化
    4.2 探究MRTF-A和 PAX7 在小鼠肌肉再生中的作用
        4.2.1 H&E染色檢測(cè)CTX損傷模型小鼠的肌肉再生情況
        4.2.2 RT-qPCR檢測(cè)MRTF-A和 PAX7 在肌肉再生過(guò)程中的表達(dá)
        4.2.3 Western blot和免疫組化檢測(cè)MRTF-A和 PAX7 在肌肉再生中的表達(dá)
    4.3 證明MRTF-A調(diào)控肌肉細(xì)胞的增殖和自我更新
        4.3.1 干擾/過(guò)表達(dá)MRTF-A穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的篩選及驗(yàn)證
        4.3.2 MRTF-A對(duì)肌肉細(xì)胞的增殖的影響
        4.3.3 MRTF-A對(duì)肌肉細(xì)胞的自我更新的影響
        4.3.4 MRTF-A對(duì)肌肉細(xì)胞的凋亡的影響
    4.4 證明MRTF-A通過(guò)影響PAX7 基因的表達(dá)進(jìn)而參與肌肉再生
        4.4.1 檢測(cè)CTX損傷小鼠肌肉再生過(guò)程中相關(guān)基因的表達(dá)情況
        4.4.2 檢測(cè)干擾/過(guò)表達(dá)MRTF-A對(duì) PAX7 及下游基因的影響
    4.5 證明MRTF-A對(duì) PAX7 基因的調(diào)控依賴其啟動(dòng)子區(qū)的CarG box元件
        4.5.1 PAX7 啟動(dòng)子區(qū)截短以及定點(diǎn)突變報(bào)告載體的構(gòu)建
        4.5.2 雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)MRTF-A對(duì) PAX7 啟動(dòng)子報(bào)告基因活性的影響
        4.5.3 通過(guò)EMSA和 ChIP檢測(cè)MRTF-A對(duì) PAX7 啟動(dòng)子區(qū)CarG box的結(jié)合
第5章 結(jié)論
第6章 討論與展望
致謝
參考文獻(xiàn)
附錄1 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文
附錄2 攻讀碩士學(xué)位期間參加的科研項(xiàng)目



本文編號(hào)：3430475