目的:探討沉默CREB基因?qū)ρ跆莿儕Z/復(fù)氧神經(jīng)元線粒體形態(tài)及細(xì)胞凋亡的影響。方法:3條靶向CREB基因的shRNA片段插入慢病毒載體pLenti Lox3.7（PLL）,與包裝質(zhì)粒psPAX2和pMD2.G共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞包裝病毒顆粒后感染原代皮層神經(jīng)元,Western blot檢測(cè)CREB蛋白的沉默情況;分別用Mito Tracker red、TUNEL和Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)氧糖剝奪/復(fù)氧誘導(dǎo)CREB基因沉默后神經(jīng)元的線粒體形態(tài)、細(xì)胞凋亡和Bcl-2、Bax的表達(dá)情況。結(jié)果:pLL-CREB-shRNA1為最有效的shRNA,其抑制皮層神經(jīng)元CREB基因表達(dá)率高達(dá)80%。CREB基因沉默促進(jìn)氧糖剝奪/復(fù)氧誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元線粒體向點(diǎn)狀、片段化形態(tài)改變,同時(shí)降低Bcl-2表達(dá)、促進(jìn)Bax的表達(dá)并加重細(xì)胞凋亡（P<0.05）。結(jié)論:CREB-shRNA重組慢病毒載體可特異性抑制神經(jīng)元CREB基因的表達(dá),CREB基因沉默加重氧糖剝奪/復(fù)氧誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元線粒體形態(tài)改變,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。 

【文章來(lái)源】：中國(guó)病理生理雜志. 2017,33(08)北大核心CSCD

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【圖文】：

pLL-CＲEB-shＲNA1對(duì)OGD/Ｒ誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元Bcl-2和Bax表達(dá)的影響

Figure6．TheexpressionofBcl-2andBaxincorticalneuronstransfectedwithpLL-CＲEB-shＲNA1．Mean±SD．n=3．*P＜0.05，＊＊P＜0.01vscontrolgroup;#P＜0.05，##P＜0.01vsOGD/Ｒgroup．圖6pLL-CＲEB-shＲNA1對(duì)OGD/Ｒ誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元Bcl-2和Bax表達(dá)的影響質(zhì)內(nèi)，確保氧化磷酸化過(guò)程順利進(jìn)行，從而生成細(xì)胞所需的能量分子ATP;而在環(huán)境脅迫及凋亡的狀態(tài)下，線粒體的形態(tài)結(jié)構(gòu)即改變?yōu)辄c(diǎn)狀，且在胞質(zhì)內(nèi)不規(guī)則分布，從而降低ATP的生成。本研究表明，氧糖剝奪/復(fù)氧處理原代皮層神經(jīng)元發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)線粒體由管狀、網(wǎng)狀的形態(tài)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)辄c(diǎn)狀、片狀形態(tài)，與缺血再灌注誘導(dǎo)的神經(jīng)元線粒體形態(tài)的改變一致。原代皮層神經(jīng)元由于其自身的生長(zhǎng)特點(diǎn)、能量需求與產(chǎn)生的特殊性以及對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的獨(dú)特要求決定其在體外培養(yǎng)的情況下對(duì)轉(zhuǎn)染的不敏感性，常用的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染效率極低且影響神經(jīng)元的活性。慢病毒載體具有可轉(zhuǎn)染非分裂細(xì)胞、目的基因表達(dá)時(shí)間長(zhǎng)以及無(wú)免疫排斥反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)而使其成為轉(zhuǎn)染神經(jīng)元最有效的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)［15］。本研究構(gòu)建的CＲEBＲNA干擾慢病毒載體轉(zhuǎn)染皮層神經(jīng)元，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后CＲEB基因表達(dá)被抑制效率可達(dá)到80%以上，充分說(shuō)明慢病毒載體系統(tǒng)在轉(zhuǎn)染原代神經(jīng)元方面的優(yōu)勢(shì)。CＲEB作為細(xì)胞內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子，在維護(hù)神經(jīng)元功能方面發(fā)揮重要的作用，如參與記憶形成與維持、神經(jīng)再生和突觸的形成等［16-17］。本研究顯示，CＲEBＲNA干擾重組慢病毒載體轉(zhuǎn)染加重氧糖剝奪/復(fù)氧誘導(dǎo)皮層神經(jīng)元線粒體的形態(tài)向點(diǎn)狀變化，并降低線粒體的質(zhì)量體積和PGC-1α的表達(dá)，說(shuō)明CＲEB基因表達(dá)的抑制影響氧糖剝奪/復(fù)氧情況下線粒體的形態(tài)結(jié)構(gòu)，且降低線粒體的生成，進(jìn)一步促進(jìn)線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變。正常情況下，Bax定位于胞質(zhì)內(nèi)，

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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