第一部分EMX2基因突變（c.478G>T）影響癲癇易感性的機制研究背景癲癇是神經(jīng)系統(tǒng)疾病中一種嚴重危害人類健康的常見病、多發(fā)病,遺傳因素是癲癇的病因之一。課題組前期應用基因捕獲測序技術在全面性發(fā)作的癲癇家系中發(fā)現(xiàn)了EMX2基因的錯義突變（c.478G>T）,導致第160號氨基酸由丙氨酸（Ala）變?yōu)榻z氨酸（Ser）（p.Ala160Ser）,該變異可能導致蛋白質(zhì)功能受到影響。EMX2基因在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中扮演了非常重要的角色,其突變可能致使神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育紊亂而誘發(fā)異常神經(jīng)網(wǎng)絡活動參與癲癇的發(fā)生發(fā)展。目的探討EMX2錯義突變（c.478G>T）對癲癇易感性的影響及可能機制。方法本研究主要采用分子生物學、原代神經(jīng)元培養(yǎng)、鼠胚大腦皮層子宮內(nèi)電穿孔建立腦內(nèi)基因轉染模型、CRISPR/Cas9技術構建條件性基因敲入小鼠模型、Cre重組酶腺相關病毒海馬立體定位注射、戊四氮慢性點燃癲癇行為學篩查以及染色質(zhì)免疫共沉淀-測序等方法。基因克隆技術分別構建野生型質(zhì)粒EMX2（160Ala）和突變型質(zhì)粒EMX2重慶醫(yī)科大學博士研究生學位論文（160Ser）,通過轉染HEK293細胞,免疫熒... 

【文章來源】：重慶醫(yī)科大學重慶市

【文章頁數(shù)】：111 頁

【學位級別】：博士

【部分圖文】：

家系癲癇患者基因測序圖及先證者發(fā)作期腦電圖

圖 1.2：不同類型質(zhì)粒的表達驗證Figure 1.2: Verification of the expression of different types of plasmids..3 突變型與野生型 EMX2 蛋白亞細胞定位情況由于人 EMX2 編碼區(qū)的第 478 號核苷酸 G 變?yōu)榱?T，導致第 160 號氨基酸氨酸（Ala）突變?yōu)榱私z氨酸（Ser），眾所周知，Ala 是不能被磷酸化的，而可以被磷酸化的，故這種突變可能導致 EMX2 蛋白翻譯后修飾的改變，使其胞定位和穩(wěn)定性發(fā)生變化，我們使用免疫熒光的方法進行了亞細胞定位檢測過在 HEK293 細胞中分別轉染帶 Flag 標簽的 Human-N-Flag-EMX2（160Alautant-N-Flag-EMX2（160Ser）和 Mouse-N-Flag-Emx2（161Ala）質(zhì)粒，48 h 后固定、通透、封閉、染色和封片，熒光顯微鏡觀察拍照。如圖 1.3 所示，F(xiàn)lag-EM紅色）與 DAPI（藍色）共定位，三組之間沒有差異，提示各種 Flag-EMX2 都定位，其亞細胞定位并沒有發(fā)生改變。

圖 1.3：不同類型 EMX2 的亞細胞定位情況Figure 1.3: Subcellular localization of wild-type and mutant EMX2.突變型與野生型 EMX2 細胞蛋白降解檢測情況如前所述，我們猜測該突變（p.Ala160Ser）是否可能會影響 EMX2 蛋白？于是，我們采用放線菌酮實驗來檢測不同類型 EMX2 蛋白的降解情況 HEK293 細胞中分別轉染野生型 PCAG-N-Flag-EMX2（160Ala）和突G-N-Flag-EMX2（160Ser）的質(zhì)粒（每組平行轉染四個 3.5 cm 的小皿）， 后加入放線菌酮（抑制蛋白合成），在加藥后的 0，4，12，24 h 分別進行取并行免疫印跡熒光檢測標簽 Flag 信號（綠色），a-tubulin（紅色）為上如圖 1.4 所示，F(xiàn)lag 綠色信號從 0-24 h 都沒有明顯衰減，提示野生型 0Ala）和突變型 EMX2（160Ser）的穩(wěn)定性并沒有差異。

【參考文獻】：
期刊論文
[1]鋰-匹羅卡品致癇大鼠腦組織中驅動蛋白家族成員17的表達情況[J]. 于岫楠,周雪穎,李新鋼,周盛年.  中華神經(jīng)科雜志. 2013 (08)



本文編號：3392187