全球每年大約有200萬人罹患自發(fā)性腦內(nèi)出血（spontaneous cerebral hemorrhage,ICH）,具有死亡率和致殘率高的特點(diǎn),并且目前治療措施效果不佳。因此,尋找腦出血治療的新策略和新靶點(diǎn)具有重要的科學(xué)意義和臨床價(jià)值。所謂化學(xué)遺傳學(xué)技術(shù)（designer receptors exclusively activated by designer drugs,DREADDs）,是利用遺傳學(xué)方法,利用化學(xué)小分子作為工具解決生物的問題,或者通過干擾、調(diào)控正常生理過程,以達(dá)到了解蛋白質(zhì)功能,是利用化學(xué)工具進(jìn)行探索和研究生命過程的一門新興學(xué)科。相關(guān)研究表明,刺激大腦皮層可能會促進(jìn)腦卒中的康復(fù),但是相關(guān)的機(jī)制目前尚不明確,在本文中,我們將利用腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染使小鼠運(yùn)動皮層表達(dá)hM3D（Gq）,并結(jié)合腹腔注射氯氮平-N-氧化物（CNO）,進(jìn)而特異性激活運(yùn)動皮層中的谷氨酸能神經(jīng)元,探討運(yùn)動皮層的谷氨酸能神經(jīng)元在腦出血小鼠的恢復(fù)過程中的作用及可能機(jī)制。本論文開展的研究如下:首先,本文將能夠靶向谷氨酸能神經(jīng)元的腺相關(guān)病毒載體,利用立體定向技術(shù)構(gòu)建化學(xué)遺傳學(xué)小鼠動物模型。飼養(yǎng)3周待病毒載體穩(wěn)定... 

【文章來源】：河北醫(yī)科大學(xué)河北省

【文章頁數(shù)】：150 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

本研究總體時(shí)間軸及化學(xué)遺傳學(xué)和腦出血動物模型構(gòu)建模式圖

一共兩孔。DREADDs病毒工具注射的第1孔和第2孔分別位于矢狀縫右側(cè)前后兩個(gè)臨近靶點(diǎn)。腦立體定位病毒注射部位冠狀位示意圖�；瘜W(xué)遺傳學(xué)病毒工具立體定向注射至右側(cè)運(yùn)動皮層M1區(qū)前后相鄰的兩個(gè)位置。

為了研究被化學(xué)遺傳學(xué)AAV病毒工具轉(zhuǎn)染的小鼠運(yùn)動皮層谷氨酸能神經(jīng)元的激活情況,我們?nèi)?0只乳鼠分別注射對照溶劑(Vehicle組)、真病毒pAAV2/9-CaMKIIα-hM3Dq-mCherry(hM3Dq組)和假病毒pAAV2/9-CaMKIIα-mCherry(mCherry組)分別注射到不同分組的8只乳鼠中。病毒注射后21天,從存活的乳鼠中各選取6只,進(jìn)行后續(xù)化學(xué)遺傳學(xué)工具運(yùn)動皮層轉(zhuǎn)染和活性鑒定實(shí)驗(yàn)。取材、切片熒光顯微鏡觀察病毒表達(dá)情況,使用免疫組化檢測c-Fos在大腦運(yùn)動皮層的表達(dá)水平驗(yàn)證化學(xué)遺傳學(xué)工具對運(yùn)動皮層谷氨酸能神經(jīng)元的激活。結(jié)果顯示:通過免疫熒光驗(yàn)證被化學(xué)遺傳學(xué)工具穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的運(yùn)動皮層谷氨酸能神經(jīng)元;腹腔注射CNO后,免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)hM3Dq組即早基因c-Fos表達(dá)較mCherry組和Vehicle組明顯增高(見表1.4,圖1.5D,*P<0.05),證實(shí)了運(yùn)動皮層谷氨酸能神經(jīng)元的興奮性增高,從而證實(shí)化學(xué)遺傳學(xué)技術(shù)可以通過局部注射化學(xué)遺傳學(xué)工具聯(lián)合腹腔注射其配體CNO激活皮層谷氨酸能神經(jīng)元。通過本部分研究可以驗(yàn)證化學(xué)遺傳學(xué)工具能夠特異性調(diào)控運(yùn)動皮層谷氨酸能神經(jīng)元的興奮性(如圖1.5)。免疫組化顯示運(yùn)動皮層c-Fos的表達(dá)情況。(A)hM3Dq組化學(xué)遺傳學(xué)病毒注射靶點(diǎn)的免疫組化顯示,聯(lián)合腹腔注射CNO后即早基因c-Fos表達(dá)水平較mCherry(B)和Vehicle組(C)明顯升高。標(biāo)尺為20um。對運(yùn)動皮層M1區(qū)c-Fos表達(dá)的神經(jīng)元數(shù)量計(jì)數(shù)(B)表明hM3Dq組較其它兩組c-Fos表達(dá)神經(jīng)元數(shù)量顯著升高(P<0.01),數(shù)據(jù)顯示為均數(shù)±SEM。


本文編號：3383232