全球每年大約有200萬人罹患自發(fā)性腦內(nèi)出血（spontaneous cerebral hemorrhage,ICH）,具有死亡率和致殘率高的特點,并且目前治療措施效果不佳。因此,尋找腦出血治療的新策略和新靶點具有重要的科學意義和臨床價值。所謂化學遺傳學技術(shù)（designer receptors exclusively activated by designer drugs,DREADDs）,是利用遺傳學方法,利用化學小分子作為工具解決生物的問題,或者通過干擾、調(diào)控正常生理過程,以達到了解蛋白質(zhì)功能,是利用化學工具進行探索和研究生命過程的一門新興學科。相關(guān)研究表明,刺激大腦皮層可能會促進腦卒中的康復,但是相關(guān)的機制目前尚不明確,在本文中,我們將利用腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染使小鼠運動皮層表達hM3D（Gq）,并結(jié)合腹腔注射氯氮平-N-氧化物（CNO）,進而特異性激活運動皮層中的谷氨酸能神經(jīng)元,探討運動皮層的谷氨酸能神經(jīng)元在腦出血小鼠的恢復過程中的作用及可能機制。本論文開展的研究如下:首先,本文將能夠靶向谷氨酸能神經(jīng)元的腺相關(guān)病毒載體,利用立體定向技術(shù)構(gòu)建化學遺傳學小鼠動物模型。飼養(yǎng)3周待病毒載體穩(wěn)定... 

【文章來源】：河北醫(yī)科大學河北省

【文章頁數(shù)】：150 頁

【學位級別】：博士

【部分圖文】：

本研究總體時間軸及化學遺傳學和腦出血動物模型構(gòu)建模式圖

一共兩孔。DREADDs病毒工具注射的第1孔和第2孔分別位于矢狀縫右側(cè)前后兩個臨近靶點。腦立體定位病毒注射部位冠狀位示意圖�；瘜W遺傳學病毒工具立體定向注射至右側(cè)運動皮層M1區(qū)前后相鄰的兩個位置。

為了研究被化學遺傳學AAV病毒工具轉(zhuǎn)染的小鼠運動皮層谷氨酸能神經(jīng)元的激活情況,我們?nèi)?0只乳鼠分別注射對照溶劑(Vehicle組)、真病毒pAAV2/9-CaMKIIα-hM3Dq-mCherry(hM3Dq組)和假病毒pAAV2/9-CaMKIIα-mCherry(mCherry組)分別注射到不同分組的8只乳鼠中。病毒注射后21天,從存活的乳鼠中各選取6只,進行后續(xù)化學遺傳學工具運動皮層轉(zhuǎn)染和活性鑒定實驗。取材、切片熒光顯微鏡觀察病毒表達情況,使用免疫組化檢測c-Fos在大腦運動皮層的表達水平驗證化學遺傳學工具對運動皮層谷氨酸能神經(jīng)元的激活。結(jié)果顯示:通過免疫熒光驗證被化學遺傳學工具穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的運動皮層谷氨酸能神經(jīng)元;腹腔注射CNO后,免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)hM3Dq組即早基因c-Fos表達較mCherry組和Vehicle組明顯增高(見表1.4,圖1.5D,*P<0.05),證實了運動皮層谷氨酸能神經(jīng)元的興奮性增高,從而證實化學遺傳學技術(shù)可以通過局部注射化學遺傳學工具聯(lián)合腹腔注射其配體CNO激活皮層谷氨酸能神經(jīng)元。通過本部分研究可以驗證化學遺傳學工具能夠特異性調(diào)控運動皮層谷氨酸能神經(jīng)元的興奮性(如圖1.5)。免疫組化顯示運動皮層c-Fos的表達情況。(A)hM3Dq組化學遺傳學病毒注射靶點的免疫組化顯示,聯(lián)合腹腔注射CNO后即早基因c-Fos表達水平較mCherry(B)和Vehicle組(C)明顯升高。標尺為20um。對運動皮層M1區(qū)c-Fos表達的神經(jīng)元數(shù)量計數(shù)(B)表明hM3Dq組較其它兩組c-Fos表達神經(jīng)元數(shù)量顯著升高(P<0.01),數(shù)據(jù)顯示為均數(shù)±SEM。


本文編號：3383232