發(fā)布時(shí)間：2021-09-03 08:31

　　研究背景:抑癌基因PTEN（phosphatase and tension homologue deleted from chromosome 10）是位于人類第十號(hào)常染色體的基因,其表達(dá)的產(chǎn)物屬于蛋白酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatases,PTP）家族,并且不同種屬的PTEN基因具有高度同源性。PTEN基因是多種生物體內(nèi)重要的調(diào)控因子,可參與多種細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等環(huán)節(jié)^[2]。另外最新的科學(xué)研究證據(jù)表明,PTEN基因在中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的生長(zhǎng)分化、軸突的修復(fù)和突觸可塑性等方面發(fā)揮著重要的調(diào)控作用,參與多種神經(jīng)退行性疾病發(fā)病機(jī)制的重要環(huán)節(jié)。早有研究指出PTEN尤其與黑質(zhì)-紋狀體的多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)^[10,11]、α-突觸核蛋白毒性^[12]、線粒體功能障礙^[13]等機(jī)制均有關(guān)聯(lián),這為帕金森疾病發(fā)病機(jī)制、潛在基因診斷位點(diǎn)以及治療靶點(diǎn)等方面提供了新的思路。故本研究選擇構(gòu)建PTEN基因多種重組質(zhì)粒并純化融合蛋白,為后續(xù)進(jìn)一步研究PTEN基因序列特性、蛋白的結(jié)構(gòu)生物學(xué)功能以及... 

【文章來源】：江蘇大學(xué)江蘇省

【文章頁(yè)數(shù)】：72 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

PTEN蛋白分子結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖

真核重組質(zhì)粒pCDNA3.1-FLAG-PTEN和原核重組質(zhì)粒pGEX-6P-1-GST-PTEN構(gòu)建及分別在HEK293細(xì)胞和E.coliBL-21中的表達(dá)8第二章原核重組質(zhì)粒pGEX-6P-1-GST-PTEN的構(gòu)建2.1實(shí)驗(yàn)材料2.1.2質(zhì)粒pGEX-6p-1-GST：可用于構(gòu)建可誘導(dǎo)、高水平表達(dá)的目的基因片段。該質(zhì)粒全長(zhǎng)4980bp，含有tap-lac（tac）啟動(dòng)子、lacI調(diào)節(jié)基因、S-D序列、lacP操縱基因、氨芐青霉素（Amp）抗性基因位點(diǎn)以及多克隆位點(diǎn)[21]。同時(shí)還含有標(biāo)簽蛋白谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶（GST）的基因序列，微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中常常運(yùn)用乳糖或類似物例如異丙基硫代半乳糖苷（Isopropylβ-D-Thiogalactoside，IPTG）來誘導(dǎo)tac啟動(dòng)子使其在大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中高水平表達(dá)出本實(shí)驗(yàn)需要的融合目的蛋白GST-PTEN，此外，載體質(zhì)粒pGEX-6p-1-GST可以誘導(dǎo)表達(dá)出分子量為26KD、具有完整酶活性的GST標(biāo)簽蛋白，有利于GST相關(guān)融合蛋白的純化，是為更精準(zhǔn)的進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)功能的研究和相關(guān)抗體的制備奠定了基矗該質(zhì)粒的測(cè)序引物：5’端：-GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG-；3’端：-CCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGG-。圖2.1pGEX-6p-1-GST質(zhì)粒圖譜Figure2.1pGEX-6p-1-GSTplasmidmapPTEN：種屬是人類。根據(jù)基因庫(kù)中查詢到人PTEN基因編碼多肽氨基酸序列(AF067844.1)，為江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)存。

收集管中。13）將上一步收集管中洗脫溶液用移液槍輕輕吸出來再重新加入吸附膜正中心，重復(fù)步驟 12，所得質(zhì)粒溶液運(yùn)用紫外光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒的濃度和純度，并做好標(biāo)記，隨后于 -20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?4）雙酶切的質(zhì)粒溶液經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析陽(yáng)性者送上海生物工程公司測(cè)序。2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.3.1 以 HEK 293 細(xì)胞中提取總 RNA 逆轉(zhuǎn)錄的 c DNA 為模板、原核目的基因片段上下游引物經(jīng) PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 1％瓊脂糖凝膠電泳后在 162 bp 處看到目的片段，符合預(yù)期值。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]帕金森病流行現(xiàn)狀[J]. 劉疏影,陳彪.  中國(guó)現(xiàn)代神經(jīng)疾病雜志. 2016(02)
[2]PTEN inhibition and axon regeneration and neural repair[J]. Yosuke Ohtake,Umar Hayat,Shuxin Li.  Neural Regeneration Research. 2015(09)



本文編號(hào)：3380780