家族型淀粉樣多神經(jīng)�。‵amilial amyloidotic polyneuropathy，F(xiàn)AP）是一種罕見(jiàn)的常染色體顯性遺傳病，與阿爾茨海默病，帕金森病等同屬于淀粉樣蛋白沉積疾病。臨床表現(xiàn)為在全身組織間隙中出現(xiàn)淀粉樣物質(zhì)沉著，早期主要損傷末梢神經(jīng)和植物神經(jīng)，晚期可累及許多內(nèi)臟器官。一般患者在癥狀出現(xiàn)后的幾年到十幾年內(nèi)死亡。因此，F(xiàn)AP屬于嚴(yán)重的致死性遺傳病。葡萄牙，瑞典和日本是FAP的多發(fā)國(guó)，我國(guó)只有十幾個(gè)FAP散在病例和家系的報(bào)道。轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白（Transthyretin，TTR）基因的點(diǎn)突變與FAP疾病密切相關(guān)。FAP患者往往可以檢測(cè)到該基因某個(gè)位點(diǎn)的突變。目前100余種TTR基因點(diǎn)突變陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，其中多數(shù)與FAP發(fā)生有關(guān)，以V30M最常見(jiàn)。人TTR基因位于18q12.1，包含4個(gè)外顯子，編譯127個(gè)氨基酸組成的蛋白單體。在正常生理環(huán)境下，未發(fā)生突變的TTR結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，以同源四聚體的形式在血漿中存在，其主要作用是運(yùn)輸甲狀腺素和維生素A。TTR基因點(diǎn)突變往往使四聚體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性下降，解離為單體，再聚合為低聚體，最后形成淀粉樣物質(zhì)沉積。目前認(rèn)為TTR蛋白的穩(wěn)定性下降是導(dǎo)致該淀粉樣物... 

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略詞表
第一章 前言
    1.1 家族型淀粉樣多神經(jīng)病
    1.2 TTR 基因點(diǎn)突變是導(dǎo)致 FAP 的主要原因
    1.3 基因突變導(dǎo)致 TTR 蛋白穩(wěn)定性下降形成低聚物和淀粉樣纖維
    1.4 TTR 蛋白低聚物和淀粉樣沉積引發(fā)細(xì)胞毒性
    1.5 FAP 疾病的治療
    1.6 論文設(shè)計(jì)依據(jù)和研究思路
    1.7 技術(shù)路線
第二章 轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白野生型、V30A、V30M 突變體的體外表達(dá)與純化
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器
        2.1.1 材料
        2.1.2 試劑
        2.1.3 溶液配制
        2.1.4 儀器
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 TTR 基因的合成
        2.2.2 pQE30-野生型 TTR 質(zhì)粒構(gòu)建
        2.2.3 pQE30-TTR V30M 和 pQE30-TTR V30A 質(zhì)粒構(gòu)建
        2.2.4 轉(zhuǎn)化 pQE30-TTRs 質(zhì)粒到 M15[pREP4]菌中
        2.2.5 TTRs 蛋白的表達(dá)
        2.2.6 TTRs 蛋白的 Ni 柱純化
        2.2.7 TTRs 蛋白的透析和凍干
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.3.1 PGE-TTR 和 pQE30 空載體質(zhì)粒雙酶切
        2.3.2 構(gòu)建 PGE-TTR V30A 和 PGE-TTR V30M 質(zhì)粒
        2.3.3 IPTG 誘導(dǎo) TTRs 蛋白表達(dá)
        2.3.4 TTRs 蛋白的可溶性檢測(cè)
        2.3.5 TTRs 蛋白的鎳柱純化
    2.4 討論
    2.5 小結(jié)
第三章 轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白野生型、V30A、V30M 突變體體外穩(wěn)定性研究
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器
        3.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.2 試劑
        3.1.3 溶液配制
        3.1.4 儀器
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 OD400nm 光密度分析
        3.2.2 ThT 熒光檢測(cè)法
        3.2.4 等溫微量熱滴定法
        3.2.5 SDS-PAGE 電泳
        3.2.6 白藜蘆醇結(jié)合分析
        3.2.7 色氨酸熒光檢測(cè)
        3.2.8 圓二色譜法
        3.2.9 分子動(dòng)力學(xué)模擬
        3.2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.3.1 V30A 突變對(duì) TTR 淀粉樣纖維形成的影響
        3.3.2 T_4和 Flu 對(duì) TTR 野生型和 V30A、V30M 突變體形成淀粉樣沉淀的影響
        3.3.3 用等溫微量熱滴定法檢測(cè) Flu 與 TTRs 的結(jié)合力
        3.3.4 V30A 突變對(duì) TTR 四級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響
        3.3.5 V30A 突變對(duì) TTR 三級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響
        3.3.6 V30A 突變對(duì) TTR 二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響
        3.3.7 TTR 野生型和 V30A，V30M 突變體的分子動(dòng)力學(xué)模擬
    3.4 討論
    3.5 小結(jié)
    3.6 工作展望
第四章 轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白野生型、V30A、V30M 突變體的細(xì)胞毒作用及其作用機(jī)制
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器
        4.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.2 試劑
        4.1.3 溶液配制
        4.1.4 儀器
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 IMR-32 細(xì)胞培養(yǎng)
        4.2.2 MTT 法
        4.2.3 臺(tái)盼藍(lán)染色法
        4.2.4 活性氧水平檢測(cè)
        4.2.5 免疫蛋白印跡
        4.2.6 透射電鏡
        4.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.3.1 TTRs 蛋白致 IMR-32 細(xì)胞毒性
        4.3.2 TTRs 蛋白對(duì)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的影響
        4.3.3 TTRs 對(duì)細(xì)胞內(nèi) DNA 損傷蛋白表達(dá)水平的影響
        4.3.4 TTRs 對(duì)細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白的影響
        4.3.5 TTRs 對(duì)細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白的影響
        4.3.6 TTRs 對(duì)熱休克蛋白 HSP70 的影響
        4.3.7 V30A 突變體透射電鏡形態(tài)觀察
    4.4 討論
    4.5 小結(jié)
    4.6 工作展望
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的文章及參加學(xué)術(shù)活動(dòng)
致謝



本文編號(hào)：3359172