患者腦膠質瘤細胞體外3D培養(yǎng)及應用研究
發(fā)布時間：2021-08-23 12:57
腦膠質瘤是一種常見的中樞神經(jīng)腫瘤,并且預后較差,中位生存期一般僅為12-15個月。目前,膠質瘤治療失敗的主要原因之一是腫瘤細胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性。藥物體外檢測模型的缺點是難以提供一個良好的腫瘤微環(huán)境,導致體外試驗與體內用藥結果不符,最近幾年內,細胞培養(yǎng)正逐漸由“二維單層”邁向“三維立體”�；颊哐苌娜S（Three-Dimensional,3D）培養(yǎng)物,也可稱為類器官,是一種新的體外腫瘤模型,可以更好的模擬體內腫瘤環(huán)境,有望為臨床用藥提供指導。在本研究中,獲得了20例新鮮的神經(jīng)膠質瘤腫瘤組織,包括星形細胞瘤和膠質母細胞瘤,膠質瘤組織分離出細胞后,直接在基于Matrigel的3D系統(tǒng)中進行培養(yǎng)。結果發(fā)現(xiàn),來自不同患者的3D培養(yǎng)物表現(xiàn)出不同的形態(tài)特征,這可能與患者的臨床特征有關,膠質母細胞瘤3D培養(yǎng)物的外觀具有不規(guī)則的邊緣和更多的突起,而星形膠質細胞3D培養(yǎng)物表現(xiàn)出相對圓形的形狀。細胞3D培養(yǎng)一個月后,石蠟切片的蘇木精伊紅染色結果表明,3D培養(yǎng)物有一定組織形態(tài),且與親本組織形態(tài)結構相似保留了親本組織的核異常性。免疫組織化學染色結果表明,3D培養(yǎng)物對于親本組織的分子表達都得以維持。細胞培養(yǎng)...
【文章來源】：長春理工大學吉林省
【文章頁數(shù)】：61 頁
【學位級別】：碩士
【部分圖文】：
細胞梯度分離示意圖
第二章實驗材料與方法17細胞，細胞用臺盼藍試劑染色計數(shù)。將5μLPBS中的2-4×105個細胞注射到雄性裸鼠的右側紋狀體中。（2）提前將微量進樣器、剪刀等進行紫外照射20min以上，并用酒精消毒。滅菌裸鼠以4%水合氯醛（400mg/kg體量，裸鼠約200μL/只）注射腹腔麻醉，10-20min后，先固定好小鼠，接著用剪刀沿著小鼠頭部矢狀縫的方向將皮膚剪開，再用棉簽蘸取3%H2O2擦拭顱骨使小鼠顱骨外層的結締組織腐蝕破壞，露出顱骨，找到小鼠矢狀縫和前囟點。（3）將微量進樣器用夾持器固定在腦立體定位儀上（圖2.2），調整其位置，使針頭正好位于前囟上方，定為原點。立體定位儀顯示歸零：X:0.00，Y:0.00，Z:0.00。（4）將微量進樣器針頭從原點處向右移2.0mm，向下移1.0mm，進針深度為3.0mm，立體定位儀顯示為注射位置：X:-2.00，Y:1.00，Z:-3.00。（5）靜置2min,將細胞以1μL/min的速度注入小鼠腦內，然后靜置3min，接著緩慢拔出針頭，每拔0.5mm稍微靜置（60s），3min左右完全拔出，小鼠做標記。（6）輕輕將小鼠從定位儀上取出，縫合皮膚切口，注意消毒。把鼠緩慢放到溫度適合的飼養(yǎng)盒內，等待蘇醒，第二天觀察小鼠是否有傷口感染，身體狀態(tài)情況。（7）后續(xù)定期小鼠稱重，觀察外形與精神狀態(tài)。小鼠體重短期內（1-2周）驟減，有弓背現(xiàn)象，表明小鼠腦部可能成瘤。后續(xù)操作：1)心臟灌流并取腦，腦組織用4%PFA(表2.14)室溫固定1-2天，20%蔗糖、30%蔗糖4℃梯度脫水，之后OCT包埋，冰凍切片14μm；2)處死，取腦獲取腫瘤細胞（實驗2.2.1），繼續(xù)建立原位移植模型。圖2.2小鼠膠質瘤原位模型建立示意圖2.2.3細胞在Matrigel中3D培養(yǎng)（1）通過在兩個PCR板之間輕輕按壓封口膜，制作“凹窩”，得到大小相對一致的凹陷壓痕模具，如下圖2.3，之后紫外過夜照射，滅菌。
Matrigel 基質膠和 20%(3 μL)細胞懸液。之后，15 μL 混合液加到圖 2.3 中模具的孔中，之后模具放入無菌培養(yǎng)皿中保護，并置于 37℃培養(yǎng)箱中 1 h 以固化。注意：基質膠在4℃冰箱中過夜融化，所有接觸到基質膠的槍頭需要預冷。 （3）將新形成的類器官轉移到低粘附的 24 孔板中，并加入完全培養(yǎng)基（表 2.6），在不搖動的情況下培養(yǎng) 7 天。7 天后，將細胞轉移到培養(yǎng)箱中的軌道振蕩器上，并以60-80 RPM 振蕩培養(yǎng)。 （4）每 3-4 天更新完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)液更新情況由細胞生長狀況決定。 （5）細胞 3D 培養(yǎng) 1-2 個月后，將細胞團取出，PBS 洗 1-2 次，4% PFA 固定，送去公司石蠟切片（塞維爾生物技術公司）。
【參考文獻】：
期刊論文
[1]骨髓間充質干細胞在Matrigel凝膠支架上的生長與變化[J]. 張斌斌,高全文,李冰,黃沙,姚斌. 中國組織工程研究. 2018(13)
本文編號：3357911
【文章來源】：長春理工大學吉林省
【文章頁數(shù)】：61 頁
【學位級別】：碩士
【部分圖文】：
細胞梯度分離示意圖
第二章實驗材料與方法17細胞，細胞用臺盼藍試劑染色計數(shù)。將5μLPBS中的2-4×105個細胞注射到雄性裸鼠的右側紋狀體中。（2）提前將微量進樣器、剪刀等進行紫外照射20min以上，并用酒精消毒。滅菌裸鼠以4%水合氯醛（400mg/kg體量，裸鼠約200μL/只）注射腹腔麻醉，10-20min后，先固定好小鼠，接著用剪刀沿著小鼠頭部矢狀縫的方向將皮膚剪開，再用棉簽蘸取3%H2O2擦拭顱骨使小鼠顱骨外層的結締組織腐蝕破壞，露出顱骨，找到小鼠矢狀縫和前囟點。（3）將微量進樣器用夾持器固定在腦立體定位儀上（圖2.2），調整其位置，使針頭正好位于前囟上方，定為原點。立體定位儀顯示歸零：X:0.00，Y:0.00，Z:0.00。（4）將微量進樣器針頭從原點處向右移2.0mm，向下移1.0mm，進針深度為3.0mm，立體定位儀顯示為注射位置：X:-2.00，Y:1.00，Z:-3.00。（5）靜置2min,將細胞以1μL/min的速度注入小鼠腦內，然后靜置3min，接著緩慢拔出針頭，每拔0.5mm稍微靜置（60s），3min左右完全拔出，小鼠做標記。（6）輕輕將小鼠從定位儀上取出，縫合皮膚切口，注意消毒。把鼠緩慢放到溫度適合的飼養(yǎng)盒內，等待蘇醒，第二天觀察小鼠是否有傷口感染，身體狀態(tài)情況。（7）后續(xù)定期小鼠稱重，觀察外形與精神狀態(tài)。小鼠體重短期內（1-2周）驟減，有弓背現(xiàn)象，表明小鼠腦部可能成瘤。后續(xù)操作：1)心臟灌流并取腦，腦組織用4%PFA(表2.14)室溫固定1-2天，20%蔗糖、30%蔗糖4℃梯度脫水，之后OCT包埋，冰凍切片14μm；2)處死，取腦獲取腫瘤細胞（實驗2.2.1），繼續(xù)建立原位移植模型。圖2.2小鼠膠質瘤原位模型建立示意圖2.2.3細胞在Matrigel中3D培養(yǎng)（1）通過在兩個PCR板之間輕輕按壓封口膜，制作“凹窩”，得到大小相對一致的凹陷壓痕模具，如下圖2.3，之后紫外過夜照射，滅菌。
Matrigel 基質膠和 20%(3 μL)細胞懸液。之后，15 μL 混合液加到圖 2.3 中模具的孔中，之后模具放入無菌培養(yǎng)皿中保護，并置于 37℃培養(yǎng)箱中 1 h 以固化。注意：基質膠在4℃冰箱中過夜融化，所有接觸到基質膠的槍頭需要預冷。 （3）將新形成的類器官轉移到低粘附的 24 孔板中，并加入完全培養(yǎng)基（表 2.6），在不搖動的情況下培養(yǎng) 7 天。7 天后，將細胞轉移到培養(yǎng)箱中的軌道振蕩器上，并以60-80 RPM 振蕩培養(yǎng)。 （4）每 3-4 天更新完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)液更新情況由細胞生長狀況決定。 （5）細胞 3D 培養(yǎng) 1-2 個月后，將細胞團取出，PBS 洗 1-2 次，4% PFA 固定，送去公司石蠟切片（塞維爾生物技術公司）。
【參考文獻】：
期刊論文
[1]骨髓間充質干細胞在Matrigel凝膠支架上的生長與變化[J]. 張斌斌,高全文,李冰,黃沙,姚斌. 中國組織工程研究. 2018(13)
本文編號：3357911
本文鏈接：http://sikaile.net/yixuelunwen/shenjingyixue/3357911.html
最近更新
教材專著
