第一部分載體的構(gòu)建、鑒定和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的建立目的：構(gòu)建并鑒定能夠在人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)的三種真核表達(dá)載體：pcDNA3.1（+）-hIDH1（mu）/3×Flag/IRES/eGFP、 pcDNA3.1（+）-hIDH1（wt）/3×Flag/IRES/eGFP和pcDNA3.1（+）-eGFP。將上述三種載體分別轉(zhuǎn)染人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞系，通過G418抗性篩選，以獲得三個(gè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系U87/mu、U87/wt和U87/vector。其中U87/mu能夠表達(dá)R132H型突變IDH1，U87/wt能夠表達(dá)野生型IDH1。方法：設(shè)計(jì)PCR引物擴(kuò)增目的基因hIDH1（mu）/3×Flag/IRES/eGFP、hIDH1（wt）/3×Flag/IRES/eGFP和eGFP，分別在上述片段的5’端添加NheⅠ位點(diǎn)，3’端添加XhoⅠ位點(diǎn)后，經(jīng)雙酶切定向克隆入pcDNA3.1（+）骨架；轉(zhuǎn)化大腸桿菌Stbl3后挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒，PCR或雙酶切及DNA測(cè)序鑒定。將上述鑒定正確的三種載體分別轉(zhuǎn)染人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞系，經(jīng)過G418抗性篩選培養(yǎng)后，倒置熒光顯微鏡拍照及Western blot... 

【文章來源】：蘇州大學(xué)江蘇省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：114 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

菌落電泳鑒定圖

R132H 型 IDH1 突變?cè)谀z質(zhì)瘤中作用的初步研究 第一部分5761 AAAACTCTCA AGGATCTTAC CGCTGTTGAG ATCCAGTTCG ATGTAACCCA CTCGTGCACC5821 CAACTGATCT TCAGCATCTT TTACTTTCAC CAGCGTTTCT GGGTGAGCAA AAACAGGAAG5881 GCAAAATGCC GCAAAAAAGG GAATAAGGGC GACACGGAAA TGTTGAATAC TCATACTCTT5941 CCTTTTTCAA TATTATTGAA GCATTTATCA GGGTTATTGT CTCATGAGCG GATACATATT6001 TGAATGTATT TAGAAAAATA AACAAATAGG GGTTCCGCGC ACATTTCCCC GAAAAGTGCC6061 ACCTGACGTC說明：將 pcDNA3.1(+)-hIDH1(mu)/3×Flag/IRES/eGFP 序列中用第 1301 位鮮綠色標(biāo)識(shí)的 G 替換為 A 即可得到 pcDNA3.1(+)-hIDH1(mu)/3×Flag/IRES/eGFP 的序列。序列中粉紅色字體為 hIDH1(wt)，序列中天藍(lán)色字體為 3×Flag，序列中橙色字體為 IRES，序列中綠色字體 eGFP，序列中黃色字體為 Kozak 序列，序列中藍(lán)色字體為 NheⅠ，序列中紅色字體為 XhoⅠ。

28圖 1-4：轉(zhuǎn)染試劑（梭華-SofastTM）和質(zhì)粒 DNA 最佳配比比例6.G418 篩選濃度的確定G418 最佳篩選濃度實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：U87 細(xì)胞在 100~1000μg/ml 的不同濃度梯度篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng) 14 天后，300μg/ml 組培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞全部死亡，而 200μg/ml 組培養(yǎng)瓶中尚有占初始細(xì)胞數(shù)約 80%的細(xì)胞存活。確定最佳 G418 篩選濃度為 300μg/ml。7.轉(zhuǎn)染后三組照片（初步轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染）轉(zhuǎn)染試劑（梭華-SofastTM）和質(zhì)粒 DNA 最佳配比比例實(shí)驗(yàn)中，熒光顯微鏡下，轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒 DNA 按不同配比（4：1、8：1、16：1、32：1）轉(zhuǎn)染 U87 細(xì)胞（以轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1(+)-eGFP 質(zhì)粒為例）24h 后在熒光顯微鏡下拍照顯示：4：1 和 8：1組轉(zhuǎn)染效率為 0；16：1 組轉(zhuǎn)染效率約為 5%，32：1 組轉(zhuǎn)染效率約為 15%（圖 1-5a）。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]VEGF121和BMP2雙基因共表達(dá)重組腺病毒載體的構(gòu)建及其在HEK293中的表達(dá)[J]. 栗剛,吳秀成,鐘聲,王巍,李媛,劉丹平.  山東醫(yī)藥. 2011(10)
[2]人BMP2及VEGF雙基因共表達(dá)腺病毒穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定[J]. 孫立,田曉濱,張宇坤,郜勇,楊述華.  山東醫(yī)藥. 2006(14)
[3]新一代陽離子聚合物轉(zhuǎn)染試劑（梭華-Sofast）轉(zhuǎn)染效果研究[J]. 楊天賜,陳明橋,黃革玲.  廈門大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2004(04)



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