目的:基于MassARRAY質(zhì)譜分析技術(shù)建立腦膠質(zhì)瘤6個(gè)基因11個(gè)位點(diǎn)的突變檢測方法。方法:通過文獻(xiàn)檢索并結(jié)合對腦膠質(zhì)瘤分子病理的研究進(jìn)展,確定了與臨床分級、診斷、及預(yù)后密切相關(guān)的6個(gè)靶基因,對目的基因進(jìn)行突變位點(diǎn)篩選并確定熱點(diǎn)突變。按MassARRAY突變位點(diǎn)標(biāo)示方法和引物設(shè)計(jì)固定格式,將基因突變位點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)注,并利用Agena BioScience在線軟件,設(shè)計(jì)突變位點(diǎn)的正、反向擴(kuò)增引物和延伸引物。收集40例腦膠質(zhì)瘤患者的石蠟樣本建立檢測方法,并采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）聯(lián)合一代測序方法進(jìn)行結(jié)果驗(yàn)證。結(jié)果:篩選出8對擴(kuò)增引物和11條延伸引物,通過2組多重PCR擴(kuò)增延伸及質(zhì)譜解吸電離技術(shù)實(shí)現(xiàn)11個(gè)位點(diǎn)的基因分型檢測。與一代測序法相比靈敏度為100%,特異度為97%。結(jié)論:成功建立MassARRAY質(zhì)譜分析腦膠質(zhì)瘤6個(gè)基因11個(gè)位點(diǎn)突變檢測方法,與一代測序相比質(zhì)譜分析法更經(jīng)濟(jì)和更節(jié)約時(shí)間。 

【文章來源】：分析儀器. 2020,(06)

【文章頁數(shù)】：7 頁

【部分圖文】：

前5個(gè)基因突變位點(diǎn)的質(zhì)譜圖型

后6個(gè)基因突變位點(diǎn)質(zhì)譜圖型

一代測序技術(shù)是熒光標(biāo)記測序法，儀器通過檢測ddNTP上的熒光來讀取所測序列，熒光染料會干擾測序引物相鄰的幾十個(gè)堿基信號，導(dǎo)致無法讀出序列，加之引物本身不含熒光，都是沒信號的部分，這也要求設(shè)計(jì)引物時(shí)引物序列需距檢測的目標(biāo)位點(diǎn)最少60bp以上；且測序前需純化回收PCR片段，為了保證回收效率，擴(kuò)增的PCR片段長度不易低于200bp。與MassArray技術(shù)不同，引物前無需加標(biāo)簽序列，其他仍需遵循引物設(shè)計(jì)原則。兩種技術(shù)檢測結(jié)果見表3，突變位點(diǎn)檢測一致率為96.4%，有2例樣本1號和2號分別在H3.3和IDH1兩個(gè)指標(biāo)檢測中結(jié)果不一致。如圖3、圖4是1號樣本兩種方法檢測結(jié)果，從質(zhì)譜圖上可見H3.3(27）這個(gè)位點(diǎn)發(fā)生了A/T突變，分子量在5171.3處的T峰面積約為13，分子量5114.4處的A峰面積約為125；而圖4一代測序所示無突變。同樣圖5、圖6是2號樣本檢測結(jié)果，圖5質(zhì)譜圖上顯示IDH1(132）位發(fā)生A/G堿基突變，A峰面積約84,G峰面積324，根據(jù)峰面積可計(jì)算突變比率；圖6箭頭所示背景峰高，無法判斷是否發(fā)生突變。表4示40例樣本在IDH1和H3.3兩個(gè)位點(diǎn)檢測結(jié)果比較，可知MassARRAY靈敏度能達(dá)100%，與一代測序檢測的真陰性數(shù)據(jù)相比62/64，特異度約97%。造成這種差異的原因與一代測序技術(shù)靈敏度低，大于20%以上的突變才能被檢測到有關(guān)[12]。測序反應(yīng)的信號強(qiáng)弱除與模板量有關(guān)，還與同一位置不同堿基信號強(qiáng)度不同有關(guān)；這會導(dǎo)致即使突變的模板所占的比例較高時(shí)，也不一定能準(zhǔn)確檢測到突變的存在。另外，測序儀軟件對掃描結(jié)果處理時(shí)，一般會將信號弱的峰做為背景信號處理，進(jìn)一步壓低弱的峰，提高主峰，因此對低含量的突變不易檢測，高含量突變檢測到也不能定量判讀。且高GC、重復(fù)序列，復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)的DNA片段對一代測序是個(gè)巨大挑戰(zhàn)，普通PCR條件很難擴(kuò)增出單一目的條帶，需利用高效熱啟動酶，梯度PCR程序及多對引物優(yōu)化才能擴(kuò)增出目的條帶[13,14]，測序時(shí)需添加變性劑優(yōu)化測序信號。質(zhì)譜方法中因擴(kuò)增的PCR片段短，可避開一些復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)；延伸引物只需延伸一個(gè)堿基后進(jìn)行質(zhì)譜鑒定其分子量。另外MassAR-RAY系統(tǒng)反應(yīng)體系為非雜交依賴性，不存在潛在的雜交錯配干擾，無需各種標(biāo)記。與芯片技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合，使得它具備高度特異性、靈敏度和高精確度[15]。能夠以快速精確的進(jìn)行基因型識別，直接測出帶有SNP或其他突變的目標(biāo)DNA[16]。圖4 一代測序檢測1號樣本H3.3-27位點(diǎn)的結(jié)果

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]免疫組化和直接測序以及焦磷酸測序?qū)DH1突變的比較研究[J]. 趙煥英,方霄,李慎濤,甄亞萍,李峰,王雷明.  實(shí)驗(yàn)技術(shù)與管理. 2019(10)
[2]中國核酸質(zhì)譜應(yīng)用專家共識[J]. 陳琛,劉昕超,張海燕.  中華醫(yī)學(xué)雜志. 2018 (12)



本文編號：3258896