目的:基于MassARRAY質(zhì)譜分析技術(shù)建立腦膠質(zhì)瘤6個(gè)基因11個(gè)位點(diǎn)的突變檢測(cè)方法。方法:通過(guò)文獻(xiàn)檢索并結(jié)合對(duì)腦膠質(zhì)瘤分子病理的研究進(jìn)展,確定了與臨床分級(jí)、診斷、及預(yù)后密切相關(guān)的6個(gè)靶基因,對(duì)目的基因進(jìn)行突變位點(diǎn)篩選并確定熱點(diǎn)突變。按MassARRAY突變位點(diǎn)標(biāo)示方法和引物設(shè)計(jì)固定格式,將基因突變位點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)注,并利用Agena BioScience在線軟件,設(shè)計(jì)突變位點(diǎn)的正、反向擴(kuò)增引物和延伸引物。收集40例腦膠質(zhì)瘤患者的石蠟樣本建立檢測(cè)方法,并采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）聯(lián)合一代測(cè)序方法進(jìn)行結(jié)果驗(yàn)證。結(jié)果:篩選出8對(duì)擴(kuò)增引物和11條延伸引物,通過(guò)2組多重PCR擴(kuò)增延伸及質(zhì)譜解吸電離技術(shù)實(shí)現(xiàn)11個(gè)位點(diǎn)的基因分型檢測(cè)。與一代測(cè)序法相比靈敏度為100%,特異度為97%。結(jié)論:成功建立MassARRAY質(zhì)譜分析腦膠質(zhì)瘤6個(gè)基因11個(gè)位點(diǎn)突變檢測(cè)方法,與一代測(cè)序相比質(zhì)譜分析法更經(jīng)濟(jì)和更節(jié)約時(shí)間。 

【文章來(lái)源】：分析儀器. 2020,(06)

【文章頁(yè)數(shù)】：7 頁(yè)

【部分圖文】：

前5個(gè)基因突變位點(diǎn)的質(zhì)譜圖型

后6個(gè)基因突變位點(diǎn)質(zhì)譜圖型

一代測(cè)序技術(shù)是熒光標(biāo)記測(cè)序法，儀器通過(guò)檢測(cè)ddNTP上的熒光來(lái)讀取所測(cè)序列，熒光染料會(huì)干擾測(cè)序引物相鄰的幾十個(gè)堿基信號(hào)，導(dǎo)致無(wú)法讀出序列，加之引物本身不含熒光，都是沒(méi)信號(hào)的部分，這也要求設(shè)計(jì)引物時(shí)引物序列需距檢測(cè)的目標(biāo)位點(diǎn)最少60bp以上；且測(cè)序前需純化回收PCR片段，為了保證回收效率，擴(kuò)增的PCR片段長(zhǎng)度不易低于200bp。與MassArray技術(shù)不同，引物前無(wú)需加標(biāo)簽序列，其他仍需遵循引物設(shè)計(jì)原則。兩種技術(shù)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3，突變位點(diǎn)檢測(cè)一致率為96.4%，有2例樣本1號(hào)和2號(hào)分別在H3.3和IDH1兩個(gè)指標(biāo)檢測(cè)中結(jié)果不一致。如圖3、圖4是1號(hào)樣本兩種方法檢測(cè)結(jié)果，從質(zhì)譜圖上可見(jiàn)H3.3(27）這個(gè)位點(diǎn)發(fā)生了A/T突變，分子量在5171.3處的T峰面積約為13，分子量5114.4處的A峰面積約為125；而圖4一代測(cè)序所示無(wú)突變。同樣圖5、圖6是2號(hào)樣本檢測(cè)結(jié)果，圖5質(zhì)譜圖上顯示IDH1(132）位發(fā)生A/G堿基突變，A峰面積約84,G峰面積324，根據(jù)峰面積可計(jì)算突變比率；圖6箭頭所示背景峰高，無(wú)法判斷是否發(fā)生突變。表4示40例樣本在IDH1和H3.3兩個(gè)位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果比較，可知MassARRAY靈敏度能達(dá)100%，與一代測(cè)序檢測(cè)的真陰性數(shù)據(jù)相比62/64，特異度約97%。造成這種差異的原因與一代測(cè)序技術(shù)靈敏度低，大于20%以上的突變才能被檢測(cè)到有關(guān)[12]。測(cè)序反應(yīng)的信號(hào)強(qiáng)弱除與模板量有關(guān)，還與同一位置不同堿基信號(hào)強(qiáng)度不同有關(guān)；這會(huì)導(dǎo)致即使突變的模板所占的比例較高時(shí)，也不一定能準(zhǔn)確檢測(cè)到突變的存在。另外，測(cè)序儀軟件對(duì)掃描結(jié)果處理時(shí)，一般會(huì)將信號(hào)弱的峰做為背景信號(hào)處理，進(jìn)一步壓低弱的峰，提高主峰，因此對(duì)低含量的突變不易檢測(cè)，高含量突變檢測(cè)到也不能定量判讀。且高GC、重復(fù)序列，復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)的DNA片段對(duì)一代測(cè)序是個(gè)巨大挑戰(zhàn)，普通PCR條件很難擴(kuò)增出單一目的條帶，需利用高效熱啟動(dòng)酶，梯度PCR程序及多對(duì)引物優(yōu)化才能擴(kuò)增出目的條帶[13,14]，測(cè)序時(shí)需添加變性劑優(yōu)化測(cè)序信號(hào)。質(zhì)譜方法中因擴(kuò)增的PCR片段短，可避開(kāi)一些復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)；延伸引物只需延伸一個(gè)堿基后進(jìn)行質(zhì)譜鑒定其分子量。另外MassAR-RAY系統(tǒng)反應(yīng)體系為非雜交依賴性，不存在潛在的雜交錯(cuò)配干擾，無(wú)需各種標(biāo)記。與芯片技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合，使得它具備高度特異性、靈敏度和高精確度[15]。能夠以快速精確的進(jìn)行基因型識(shí)別，直接測(cè)出帶有SNP或其他突變的目標(biāo)DNA[16]。圖4 一代測(cè)序檢測(cè)1號(hào)樣本H3.3-27位點(diǎn)的結(jié)果

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]免疫組化和直接測(cè)序以及焦磷酸測(cè)序?qū)DH1突變的比較研究[J]. 趙煥英,方霄,李慎濤,甄亞萍,李峰,王雷明.  實(shí)驗(yàn)技術(shù)與管理. 2019(10)
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