杜興肌肉萎縮癥（Duchenne Muscular Dystrophy-DMD）是一種致死性的X染色體連鎖隱性遺傳神經(jīng)肌肉失調(diào)癥,由于DMD基因突變,導(dǎo)致功能性dystrophin蛋白缺失所致,目前臨床上缺乏有效的治療手段。其臨床表征主要為全身肌肉進(jìn)行性退化萎縮,最終致死。在本研究中,擬對(duì)臨床常用的食品級(jí)小分子化合物進(jìn)行篩選和鑒定,通過(guò)在DMD小鼠（mdx）模型上的局部和系統(tǒng)測(cè)試,以期發(fā)現(xiàn)能夠改善mdx小鼠肌肉病理、炎癥和促進(jìn)肌肉再生及分化的小分子化合物,為DMD輔助治療提供新的候選藥物。首先利用體外肌肉細(xì)胞模型,通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)細(xì)胞增殖速度,以篩選能夠增強(qiáng)細(xì)胞增殖的候選小分子化合物。在mdx小鼠模型上,對(duì)候選小分子化合物進(jìn)行局部和系統(tǒng)篩選測(cè)試,通過(guò)免疫熒光、膠原和炎癥病理染色等方法,以確認(rèn)候選化合物對(duì)肌肉再生和病理的改善作用。為檢測(cè)不同給藥途徑,對(duì)候選化合物作用效果的影響,擬測(cè)試飼喂和尾靜脈注射兩種途徑,通過(guò)免疫熒光染色、H&E染色等方法,以確認(rèn)不同給藥方式對(duì)候選小分子化合物作用效果的影響。為測(cè)試候選化合物長(zhǎng)期的作用效果,擬對(duì)mdx小鼠進(jìn)行為期3月的系統(tǒng)治療,通過(guò)抓力測(cè)試、... 

【文章來(lái)源】：天津醫(yī)科大學(xué)天津市 211工程院校

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

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Dystrophin蛋白結(jié)構(gòu)示例圖

結(jié)果2.1 小分子化合物在杜興肌肉萎縮癥上的篩選和鑒定2.1.1 小分子化合物的體外篩選前期報(bào)道不同的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如支鏈氨基酸，精氨酸等應(yīng)用于 DMD 病人的臨輔助治療，但其效果有限[6]-[11]。為了篩選更有效的小分子化合物，我們利用鼠 C2C12 成肌細(xì)胞模型，通過(guò)篩選能夠促進(jìn)肌肉細(xì)胞增殖的小分子化合物，期發(fā)現(xiàn)改善 DMD 臨床病癥的小分子化合物。通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)來(lái)檢測(cè)細(xì)胞增殖況，我們發(fā)現(xiàn)在 G1、G2、G3、G4、G5、G6 和 G7 這幾類(lèi)小分子化合物中，GG2、G3 和 G5 對(duì)細(xì)胞增殖作用最為明顯，其中 G1 效果最強(qiáng)，經(jīng) 24h 處理后使細(xì)胞數(shù)目由 8000 個(gè)增殖到 25000 個(gè)，相對(duì)于 10% FBS 正常培養(yǎng)基處理組，有顯著性差異，結(jié)果見(jiàn)圖 2A，B。進(jìn)一步選用 cck8 試劑盒進(jìn)行細(xì)胞增殖活性測(cè)，結(jié)果表明 G1、G3 和 G5 相對(duì)于正常培養(yǎng)組，其細(xì)胞活性的 ratio 比能達(dá)1.7（圖 2C），綜上說(shuō)明，G1、G2、G3 和 G5 是促進(jìn)肌肉細(xì)胞增殖的候選化合物

天津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文 結(jié)果處理后的細(xì)胞個(gè)數(shù)統(tǒng)計(jì)（*P < 0.05, n=3）。（C）CCK8 試劑盒檢測(cè)的細(xì)胞活性統(tǒng)計(jì)（*P< 0.05, n=3）。2.1.2 候選小分子化合物在 mdx 小鼠上的局部篩選體外測(cè)試結(jié)果顯示：G1、G2、G3 和 G5 對(duì)肌肉細(xì)胞表現(xiàn)為更強(qiáng)的促進(jìn)增殖效果，為驗(yàn)證這些候選小分子化合物在體內(nèi)的作用效果，本研究將在 mdx 小鼠上進(jìn)行局部篩選。分別將 G1、G2、G3 和 G5 在 mdx 小鼠前肌骨肌肉上測(cè)試，使用濃度均為 5%，以生理鹽水在前脛骨肌肉上測(cè)試為對(duì)照，單次注射，注射 3天后收樣，檢測(cè)小鼠肌肉的新生情況。利用 IHC 檢測(cè)新生肌纖維標(biāo)記蛋白（eMyHC）陽(yáng)性肌纖維的分布和表達(dá)情況，結(jié)果顯示：在這四種處理組中，相對(duì)于生理鹽水對(duì)照組，G1 處理組 eMyHC 陽(yáng)性肌纖維分布更為均一，數(shù)量更多，能達(dá)到 300 個(gè)，其次為 G3，eMyHC 陽(yáng)性肌纖維數(shù)能達(dá)到 200 個(gè)，說(shuō)明 G1 誘導(dǎo)新生肌纖維產(chǎn)生的效果較佳（圖 3）。


本文編號(hào)：3249094