本文關鍵詞：山黧豆神經(jīng)性中毒的細胞信號途徑及分子機理研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：山黧豆(Lathyrus sativas L.)是優(yōu)良的旱地作物種質(zhì)資源,長期過量食用會導致人畜神經(jīng)性山黧豆中毒(Neurolathyrism)。神經(jīng)性山黧豆中毒是一種由β-ODAP引起的人畜神經(jīng)退行性疾病,但其細胞及分子機理尚不明確。本研究采用離體培養(yǎng)的人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系M059K作為實驗體系,以谷氨酸為對照,采用從山黧豆種子提取純的β-ODAP,使用濃度梯度的藥物處理細胞,通過分析細胞存活力與生長動態(tài)確定加藥濃度,利用流式細胞術、共聚焦顯微術、免疫細胞化學和轉(zhuǎn)錄組測序等相關技術追蹤檢測β-ODAP對細胞增殖力、細胞形態(tài)與細胞周期的變化、細胞死亡方式與DNA損傷、線粒體膜電位與細胞骨架、鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)狀況和基因差異表達的動態(tài)方面對細胞的影響的。最終通過經(jīng)典數(shù)理統(tǒng)計、顯微實證和分子表達路徑分析方法,主要得出如下結(jié)果：1.通過MTT實驗,用2-22 mM共10個濃度梯度β-ODAP及Glu處理細胞后測得的OD值,繪制細胞抑制曲線,計算得到半抑制濃度IC50=17.70 mM,為了更好地模擬體外中毒的過程,避免Glu對細胞產(chǎn)生毒性作用干擾研究,確定將10mM藥物濃度作為本研究的相關實驗的施加劑量,此時β-ODAP造成的細胞抑制率為24.6%,Glu為0.2%。2.毒素β-ODAP處理細胞,使用FITC標記的Annexin V作為探針利用流式細胞術檢測后發(fā)現(xiàn),細胞并未出現(xiàn)顯著的凋亡現(xiàn)象,不同藥物處理時間下凋亡細胞比例均低于2%；進一步通過流式細胞術檢測,未發(fā)現(xiàn)細胞周期阻滯現(xiàn)象；免疫組化實驗檢測DNA斷裂狀況,未發(fā)現(xiàn)明顯的DNA損傷；進一步通過流式細胞術檢測,未發(fā)現(xiàn)細胞周期阻滯現(xiàn)象；免疫組化實驗檢測DNA斷裂狀況,未發(fā)現(xiàn)明顯的DNA損傷,細胞克隆形成實驗結(jié)果顯示,β-ODAP可抑制細胞增殖,顯著降低克隆形成;3.毒素β-ODAP處理細胞后,使用Fluo 3-AM及Mito-Tracker M7512分別標記細胞內(nèi)鈣離子和線粒體,利用免疫組化實驗觀測二者變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),β-ODAP處理6h后便可使細胞內(nèi)鈣離子持續(xù)增多并被線粒體吸收,這種現(xiàn)象隨處理時間延長而加劇,處理24 h后部分細胞中線粒體失活。而Glu處理后鈣離子增加速度低于β-ODAP組；使用Rho 123作為指示劑,流式細胞術檢測線粒體膜電位也觀測到β-ODAP引起的持續(xù)性膜電位下降。4.毒素β-ODAP處理顯著性地破壞細胞骨架。毒素處理細胞后,使用鬼筆環(huán)肽標記細胞骨架,觀測結(jié)果顯示β-ODAP可影響細胞骨架嚴重變形坍塌,綠色熒光強度明顯減弱,F-actin聚合體發(fā)生翻轉(zhuǎn)和折疊,與細胞核分離,微絲的胞間連接出現(xiàn)斷裂。5.基因檢測和表達結(jié)果分析表明,毒素β-ODAP處理細胞24 h后,通過轉(zhuǎn)錄組測序及實時定量PCR技術測定細胞轉(zhuǎn)錄組變化情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)β-ODAP會引起細胞外基質(zhì)和黏著斑等通路上的Integrinβ1、Laminin、Fibronectin、Paxillin等16條基因差別表達,同時引起多種其他神經(jīng)退行性疾病通路中的關鍵致病基因上調(diào)。6.勾畫了毒素中毒的細胞信號途徑和初步揭示了其分子機理。上述研究結(jié)果表明,β-ODAP造成的細胞凋亡和壞死并不是其損傷神經(jīng)元的主要方式,毒素β-ODAP可以結(jié)合并異常激活神經(jīng)細胞的AMPA受體,使得β1整合蛋細胞表面表達量上升,進一步使黏著斑激酶磷酸化增加,FA蛋白單元在細胞微絲上大量聚集,誘使樁蛋白的表達量上調(diào),影響細胞骨架聚合,最終引起神經(jīng)細胞營養(yǎng)障礙。此外,大量內(nèi)流的Ca2+導致細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)失調(diào),細胞生存力和增值率迅速下降,線粒體攝取過多的Ca2+引起線粒體膜電位改變,使ATP合成受阻,ROS生成增加,進而對生物膜造成損傷,也會導致細胞損傷而死亡。上述研究結(jié)果表明,β-ODAP造成的細胞凋亡和壞死并不是其損傷神經(jīng)元的主要方式,毒素β-ODAP可以結(jié)合并異常激活神經(jīng)細胞的AMPA受體,導致Ca2+產(chǎn)生細胞內(nèi)流,使得p1整合蛋細胞表面表達量上升,進一步使黏著斑激酶磷酸化增加,黏著斑蛋白單元在細胞微絲上大量聚集,誘使樁蛋白的表達量上調(diào),影響細胞骨架聚合,最終引起神經(jīng)細胞營養(yǎng)障礙。此外,大量內(nèi)流的Ca2+導致細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)失調(diào),細胞生存力和增值率迅速下降,線粒體攝取過多的Ca2+引起線粒體膜電位改變,使ATP合成受阻,ROS生成增加,進而對生物膜造成損傷,也會導致細胞損傷而死亡。綜上所述,山黧豆神經(jīng)性中毒的信號途徑非常復雜,涉及不同層次和不同途徑的多基因調(diào)控。本研究首次采用神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞體外模擬的方式,對山黧豆神經(jīng)性中毒的細胞信號途徑和分子機理進行初步探索,初步勾畫了山黧豆中毒的細胞信號通道、基因差異表達和調(diào)控途徑,為將來防控和治愈山黧豆中毒提供理論參照。但限于作者的研究周期只有兩年,研究手段尚存在不足,暫未對β-ODAP分子進行標記和定位,相關研究有待將來進一步完善。
【關鍵詞】：L-β-N-草酰-α β-二氨基丙酸 神經(jīng)性山黧豆中毒 神經(jīng)退行性疾病 鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào) 氧化脅迫 基因表達概況分析 細胞骨架 線粒體膜電位 細胞外基質(zhì)與受體作用
【學位授予單位】：蘭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R741;R595
【目錄】：

• 中文摘要3-6
• Abstract6-12
• 第一章 文獻綜述12-21
• 1.1 山黧豆作為重要種質(zhì)資源在全球變化和糧食安全中的作用12
• 1.2 山黧豆中毒發(fā)生的歷史背景12-14
• 1.3 山黧豆中毒機理的研究進展14-20
• 1.3.1 β-ODAP引起神經(jīng)性中毒的動物實驗14-15
• 1.3.2 影響神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸正常功能15-16
• 1.3.3 破壞神經(jīng)元細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)16-17
• 1.3.4 加劇氧化脅迫破壞線粒體功能17-19
• 1.3.5 神經(jīng)性山黧豆中毒與神經(jīng)退行性疾病19-20
• 1.4 神經(jīng)性山黧豆中毒機理研究的不足20-21
• 第二章 立項依據(jù)及研究內(nèi)容21-24
• 2.1 立項依據(jù)21-22
• 2.2 研究內(nèi)容及流程圖22-23
• 2.3 主要儀器及藥品耗材23-24
• 2.3.1 主要儀器簡介23
• 2.3.2 主要耗材23-24
• 第三章 毒素β-ODAP對細胞生存率、細胞周期及死亡動態(tài)的影響24-38
• 3.1 材料與方法24-30
• 3.1.1 材料24-25
• 3.1.2 方法25-30
• 3.2 結(jié)果30-37
• 3.2.1 細胞生存力的變化30-31
• 3.2.2 細胞形態(tài)的變化31
• 3.2.3 細胞克隆形成率的變化31-32
• 3.2.4 細胞死亡動態(tài)32-35
• 3.2.5 細胞周期的變化35-36
• 3.2.6 DNA損傷的狀況36-37
• 3.3 討論37-38
• 第四章 毒素β-ODAP對細胞結(jié)構及功能的影響38-49
• 4.1 材料與方法38-40
• 4.1.1 材料38-39
• 4.1.2 方法39-40
• 4.2 結(jié)果40-46
• 4.2.2 細胞內(nèi)鈣離子濃度的變化40-43
• 4.2.2 線粒體膜電位的變化43-44
• 4.2.3 細胞骨架損傷的狀況44-46
• 4.3 討論46-49
• 4.3.1 β-ODAP與Ca~(2+)穩(wěn)態(tài)失調(diào)46
• 4.3.2 β-ODAP與氧化損傷46-47
• 4.3.3 β-ODAP與細胞骨架解體47-49
• 第五章 毒素β-ODAP對細胞基因表達狀況的影響49-65
• 5.1 材料與方法49-53
• 5.1.1 材料49-51
• 5.1.2 方法51-53
• 5.2 結(jié)果53-62
• 5.2.1 M059K細胞系的表達譜分析53-60
• 5.2.2 qRT-PCR對測序結(jié)果的驗證60-62
• 5.3 討論62-65
• 5.3.1 β-ODAP與基因差別表達活性62-65
• 第六章 經(jīng)性山黧豆中毒癥與其他神經(jīng)退行性疾病關系的探討65-69
• 6.1 不同神經(jīng)退行性疾病之間的異同點65-66
• 6.2 不同神經(jīng)退行性疾病之間的關系66
• 6.3 神經(jīng)退行性疾病神經(jīng)元死亡主要方式的探討66-69
• 第七章 主要結(jié)論及展望69-72
• 7.1 β-ODAP觸發(fā)神經(jīng)元損傷的機理69-71
• 7.2 神經(jīng)退行性疾病神經(jīng)元死亡的主要方式71-72
• 參考文獻72-78
• 在學期間的研究成果78-79
• 基金項目資助79-80
• 致謝80

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 張曉暉,姚天明,黃高f,王文亮;細胞凋亡的最新研究進展[J];第四軍醫(yī)大學學報;2002年S1期

2 劉緒川;張國偉;李雅茹;王菊香;梁兆年;史燈;鄭玉蓮;;山黧豆有毒成分(BOAA)小鼠急性中毒試驗[J];中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志;1987年01期

  本文關鍵詞：山黧豆神經(jīng)性中毒的細胞信號途徑及分子機理研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：322842