發(fā)布時(shí)間：2021-04-21 18:16

　　神經(jīng)退行性疾病（Neurodegenerative disease）是大腦或脊髓的神經(jīng)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能喪失導(dǎo)致的神經(jīng)疾病,如：阿茲海默癥、帕金森病、亨廷頓舞蹈癥和脊髓側(cè)索硬化癥等,對(duì)人類(lèi)特別是老年人的健康構(gòu)成了巨大的威脅。人們?cè)噲D通過(guò)化學(xué)藥物治療這些疾病,但都沒(méi)有取得好的效果。于是,人們嘗試通過(guò)細(xì)胞移植治療的方法修復(fù)受損神經(jīng)元。到目前為止,已經(jīng)有多種細(xì)胞通過(guò)移植實(shí)驗(yàn)被證明對(duì)神經(jīng)修復(fù)具一定作用,如多能性干細(xì)胞（PSCs）、造血干細(xì)胞（HSCs）、間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）、神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）、限制性神經(jīng)元前體細(xì)胞（NRPs）、特定的神經(jīng)元（special neurons）等。由于多能性干細(xì)胞具有自我更新和分化為各種細(xì)胞類(lèi)型的能力,然而這類(lèi)細(xì)胞分化方向難以控制,直接注射到體內(nèi)易形成畸胎瘤,所以并不適合直接用于臨床治療。造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞是成體中存在的,并且研究得最深入的三類(lèi)成體干細(xì)胞。造血干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞在一定條件下可表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞相關(guān)基因,因此臨床前研究常使用這兩類(lèi)干細(xì)胞進(jìn)行神經(jīng)退行性疾病的治療。然而,這兩類(lèi)干細(xì)胞在體內(nèi)轉(zhuǎn)分化成為神經(jīng)細(xì)胞的效率非常低,對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)安徽省 211工程院校 985工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：128 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 緒論
    1.1 引言
    1.2 體細(xì)胞重編程與轉(zhuǎn)分化研究進(jìn)展
        1.2.1 體細(xì)胞重編程
            1.2.1.1 克隆技術(shù)
            1.2.1.2 細(xì)胞融合重編程
            1.2.1.3 iPS技術(shù)及轉(zhuǎn)錄因子
            1.2.1.4 轉(zhuǎn)分化研究
    1.3 神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育
        1.3.1 神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育簡(jiǎn)介
        1.3.2 神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育
            1.3.2.1 神經(jīng)干細(xì)胞與神經(jīng)前體細(xì)胞
            1.3.2.2 神經(jīng)元前體細(xì)胞
            1.3.2.3 神經(jīng)元
            1.3.2.4 膠質(zhì)細(xì)胞
    1.4 神經(jīng)退行性疾病及細(xì)胞治療
        1.4.1 神經(jīng)退行性疾病
        1.4.2 神經(jīng)退行性疾病的治療方法
            1.4.2.1 非細(xì)胞治療方法
            1.4.2.2 細(xì)胞治療方法
    1.5 神經(jīng)細(xì)胞的分化與轉(zhuǎn)化分化研究
        1.5.1 神經(jīng)細(xì)胞的分化與轉(zhuǎn)分化概述
        1.5.2 ES/iPSC誘導(dǎo)為神經(jīng)干細(xì)胞或神經(jīng)元
        1.5.3 轉(zhuǎn)分化獲得神經(jīng)干細(xì)胞或神經(jīng)前體細(xì)胞
        1.5.4 轉(zhuǎn)分化獲得功能性神經(jīng)元
    1.6 本課題選題依據(jù)及研究?jī)?nèi)容
第二章 實(shí)驗(yàn)材料與試劑
    2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
    2.2 實(shí)驗(yàn)耗材
    2.3 實(shí)驗(yàn)儀器
    2.4 實(shí)驗(yàn)試劑和試劑盒
        2.4.1 分子實(shí)驗(yàn)用試劑
        2.4.2 細(xì)胞培養(yǎng)用試劑
        2.4.3 分子實(shí)驗(yàn)用溶液配制
        2.4.4 細(xì)胞培養(yǎng)液配制
        2.4.5 免疫熒光用溶液配制
        2.4.6 電生理用溶液配制
第三章 實(shí)驗(yàn)方法與步驟
    3.1 細(xì)胞培養(yǎng)
        3.1.1 293T細(xì)胞培養(yǎng)
        3.1.2 K562細(xì)胞培養(yǎng)
        3.1.3 U251細(xì)胞培養(yǎng)
        3.1.4 hiPS細(xì)胞培養(yǎng)
            3.1.4.1 飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備
            3.1.4.2 人誘導(dǎo)多潛能性干細(xì)胞（hiPS）細(xì)胞培養(yǎng)
        3.1.5 hiPS細(xì)胞誘導(dǎo)神經(jīng)前體細(xì)胞
        3.1.6 人胎兒皮膚成纖維細(xì)胞分離培養(yǎng)
    3.2 慢病毒包裝
        3.2.1 篩選候選基因
            3.2.1.1 引物設(shè)計(jì)合成
            3.2.1.2 RNA提取
            3.2.1.3 反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）
            3.2.1.4 PCR反應(yīng)
            3.2.1.5 電泳觀察
        3.2.2 慢病毒載體構(gòu)建
            3.2.2.1 雙酶切
            3.2.2.2 回收載體及基因片段
            3.2.2.3 目的DNA片段的連接
            3.2.2.4 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化
            3.2.2.5 重組質(zhì)粒小量提取
            3.2.2.6 重組質(zhì)粒的鑒定
            3.2.2.7 質(zhì)粒中提和保存
        3.2.3 慢病毒包裝和收集
            3.2.3.1 慢病毒包裝
            3.2.3.2 慢病毒收集
            3.2.3.3 病毒滴度測(cè)試
    3.3 神經(jīng)元前體細(xì)胞（hiNRPs）的誘導(dǎo)過(guò)程
        3.3.1 八因子誘導(dǎo)過(guò)程
        3.3.2 減少外源因子
        3.3.3 優(yōu)化誘導(dǎo)培養(yǎng)條件
    3.4 神經(jīng)元前體細(xì)胞（hiNRPs）的鑒定
        3.4.1 反轉(zhuǎn)錄PCR鑒定
        3.4.2 實(shí)時(shí)定量PCR鑒定
        3.4.3 Nestin甲基化分析
            3.4.3.1 細(xì)胞基因組DNA提取
            3.4.3.2 硫酸氫鹽對(duì)DNA進(jìn)行修飾
            3.4.3.3 PCR擴(kuò)增及連接
            3.4.3.4 測(cè)序結(jié)果分析
        3.4.4 核型分析
        3.4.5 細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)
        3.4.6 全基因組表達(dá)分析
    3.5 神經(jīng)元前體細(xì)胞（hiNRPs）的體外分化和鑒定
        3.5.1 誘導(dǎo)神經(jīng)元前體細(xì)胞（hiNRPs）的體外分化實(shí)驗(yàn)
            3.5.1.1 誘導(dǎo)神經(jīng)元
            3.5.1.2 誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞
            3.5.1.3 誘導(dǎo)少突膠質(zhì)細(xì)胞
        3.5.2 分化細(xì)胞的免疫熒光檢測(cè)
        3.5.3 hiNRP細(xì)胞分化的神經(jīng)元電生理檢測(cè)
    3.6 神經(jīng)元前體細(xì)胞（hiNRPs）的移植和鑒定
        3.6.1 神經(jīng)元前體細(xì)胞體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)
        3.6.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)
        3.6.3 腦組織切片
        3.6.4 組織免疫熒光檢測(cè)
第四章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    4.1 分離獲得人胚胎成纖維細(xì)胞和誘導(dǎo)獲得人神經(jīng)前體細(xì)胞
    4.2 載體構(gòu)建
    4.3 直接誘導(dǎo)獲得人神經(jīng)元前體細(xì)胞
    4.4 減少外源因子誘導(dǎo)神經(jīng)元前體細(xì)胞
    4.5 優(yōu)化神經(jīng)元前體細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)條件
    4.6 誘導(dǎo)神經(jīng)元前體細(xì)胞（hiNRPs）的檢測(cè)
        4.6.1 hiNRPs的形態(tài)特點(diǎn)
        4.6.2 RT-PCR和q-PCR檢測(cè)hiNRPs的基因表達(dá)
        4.6.3 免疫熒光法檢測(cè)hiNRPs的基因表達(dá)
        4.6.4 hiNRP細(xì)胞核型和成瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)
        4.6.5 Nestin增強(qiáng)子的甲基化檢測(cè)
    4.7 全基因組表達(dá)分析
    4.8 hiNRPs的體外分化檢測(cè)
    4.9 電生理檢測(cè)
    4.10 體內(nèi)分化檢測(cè)
第五章 討論
第六章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
在讀期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與取得的其他研究成果



本文編號(hào)：3152244