細菌性腦膜炎是一種重要的致死性傳染性疾病,致腦膜炎大腸桿菌（Escherichia coli,E.coli）是其主要病原,破壞血腦屏障（blood-brain barrier,BBB）是E.coli引起腦膜炎的關(guān)鍵步驟。BBB能夠通過控制相關(guān)物質(zhì)的進出使中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system,CNS）免受血液中的毒素和病原體的侵害。BBB主要由腦微血管內(nèi)皮細胞（brain microvascular endothelial cells,BMECs）、星形膠質(zhì)細胞和周細胞組成,細胞間的物質(zhì)交換與信息交流對維持BBB結(jié)構(gòu)與功能的完整性至關(guān)重要。外泌體是一種由細胞二次胞吞形成的微小囊泡,通過攜帶蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)等物質(zhì)在細胞間的信息傳遞中發(fā)揮著重要作用。E.coli通過與BMECs相互作用能夠引起B(yǎng)BB結(jié)構(gòu)完整性的喪失和功能的改變,BMECs來源的外泌體在這一過程中發(fā)揮的作用尚不清楚。為此,本研究采用致腦膜炎大腸桿菌PCN033感染BMECs細胞,并對該細胞來源的外泌體進行分離鑒定。在此基礎(chǔ)上,對感染前后BMECs來源的外泌體的功能進行了探究,并對外泌體中的miRNA進行... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：75 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞表（Abbreviation）
1 前言
    1.1 大腸桿菌
        1.1.1 大腸桿菌的分類
        1.1.2 ExPEC腦膜炎
    1.2 血腦屏障
        1.2.1 腦微血管內(nèi)皮細胞
        1.2.2 星形膠質(zhì)細胞
    1.3 外泌體
        1.3.1 外泌體的生成與運輸
        1.3.2 外泌體的成分
    1.4 miRNA
        1.4.1 miRNA的作用
        1.4.2 miRNA與外泌體
    1.5 本研究的目的和意義
2 材料及方法
    2.1 試驗材料
        2.1.1 菌株
        2.1.2 細胞系
        2.1.3 藥品試劑
        2.1.4 儀器設(shè)備
        2.1.5 各種試劑配制方法
        2.1.6 引物
    2.2 試驗方法
        2.2.1 BMECs和U251的傳代培養(yǎng)
        2.2.2 BMECs的饑餓處理
        2.2.3 細菌刺激細胞和收集樣品
        2.2.4 外泌體的提取
        2.2.5 外泌體的提純
        2.2.6 外泌體的提純后洗脫液的置換
        2.2.7 外泌體透射電鏡觀察
        2.2.8 外泌體粒徑分析
        2.2.9 細胞RNA提取和濃度測定
        2.2.10 外泌體RNA提取和濃度測定
        2.2.11 BCA法測定外泌體/細胞蛋白濃度
        2.2.12 外泌體/細胞總蛋白樣品的制備
        2.2.13 SDS-PAGE凝膠電泳
        2.2.14 Western Blotting
        2.2.15 熒光定量q PCR
        2.2.16 外泌體攝取實驗
        2.2.17 ECIS測定外泌體對BMECs細胞屏障功能的影響
        2.2.18 外泌體miRNA建庫和測序分析
        2.2.19 外泌體miRNA KEGG富集分析
        2.2.20 統(tǒng)計分析
3 結(jié)果與分析
    3.1 外泌體的分離和鑒定
    3.2 外泌體作用于BMECs
        3.2.1 外泌體能被BMECs細胞攝取
        3.2.2 PCN033感染BMECs細胞分泌的外泌體能破壞BMECs的屏障功能
        3.2.3 PCN033感染的BMECs分泌的外泌體促進BMECs活化
    3.3 外泌體作用于星形膠質(zhì)細胞U251
        3.3.1 外泌體能被U251攝取
        3.3.2 PCN033感染BMECs細胞分泌的外泌體抑制U251活化
    3.4 外泌體miRNA測序分析
        3.4.1 miRNA維恩圖分析
        3.4.2 miRNA差異表達分析
        3.4.3 miRNA聚類分析
        3.4.4 差異表達miRNA靶基因KEGG分析
    3.5 外泌體miRNA測序結(jié)果驗證和分析
        3.5.1 外泌體miRNA測序結(jié)果驗證
        3.5.2 外泌體差異表達miRNA的靶基因預(yù)測與KEGG分析
4 討論
    4.1 Ex PEC感染BMECs細胞分泌的外泌體促進BMECs上調(diào)表達ICAM-1484.2 Ex PEC感染BMECs細胞分泌的外泌體抑制U251表達GFAP
    4.2 ExPEC 感染 BMECs 細胞分泌的外泌體抑制 U251 表達GFAP
    4.3 Ex PEC感染BMECs細胞分泌的外泌體中差異表達miRNA的分析
5 結(jié)論
參考文獻
致謝



本文編號：3151766