目的構(gòu)建Sestrin2（SESN2）基因過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)SH-SY5Y細(xì)胞株,并建立OGD/R模型模擬腦缺血再灌注損傷,探討應(yīng)激誘導(dǎo)蛋白SESN2過表達(dá)對線粒體分裂的調(diào)控作用及其機制。方法慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建SESN2過表達(dá)及空載體穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株;利用SH-SY5Y細(xì)胞氧糖剝奪/恢復(fù)模型（OGD4h/R18h）模擬腦缺血再灌注損傷,實驗分為兩部分,第一部分探究SESN2過表達(dá)對SH-SY5Y細(xì)胞OGD/R模型中細(xì)胞活性、線粒體分裂的調(diào)控以及SESN2過表達(dá)對Keap1/Nrf2通路的激活作用,分為正常對照組、氧糖剝奪/恢復(fù)組、空載體組、SESN2過表達(dá)組,各組細(xì)胞進(jìn)行OGD4h/R18h,采用CCK-8檢測細(xì)胞存活率,采用Western blot檢測SESN2、Drp1、Fis1、Bcl-2、Bax、胞漿Keap1、胞核Nrf2的蛋白表達(dá),采用透射電鏡觀察線粒體的超微結(jié)構(gòu);采用免疫熒光檢測Nrf2的核移位;第二部分探究Keap1/Nrf2通路是否參與SESN2對線粒體分裂的調(diào)控,分為SESN2過表達(dá)組、通路抑制劑Brusatol+SESN2過表達(dá)組（Brusatol終濃度為100nM預(yù)處理4h）、D... 

【文章來源】：青島大學(xué)山東省

【文章頁數(shù)】：41 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

各組細(xì)胞SESN2、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的比較（***P<0.001，*P<0.05，NS:P>0.05）

青島大學(xué)碩士學(xué)位論文102.SESN2過表達(dá)在OGD/R中對線粒體分裂的影響Westernblot分析結(jié)果顯示，與對照組相比，OGD/R組和Vector+OGD/R組Drp1、Fis1蛋白水平明顯升高（P<0.001）；與OGD/R組相比，OE-SESN2+OGD/R組Drp1、蛋白水平明顯降低（P<0.001），F(xiàn)is1蛋白水平明顯降低（P<0.001），見表2、圖2A；電鏡觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)，Control組可見清晰的線粒體雙層膜結(jié)構(gòu)、線粒體嵴，而OGD/R組與Vector+OGD/R組可見線粒體腫脹，甚至空泡樣變，線粒體基質(zhì)顆粒消失、嵴結(jié)構(gòu)破壞。OE-SESN2+OGD/R組線粒體較完整，可見清晰的基質(zhì)顆粒、線粒體嵴，結(jié)構(gòu)基本正常，見圖2B。結(jié)果表明SESN2過表達(dá)能在氧糖剝奪/復(fù)糖復(fù)氧損傷中可下調(diào)Drp1、Fis1從而抑制線粒體分裂，保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)的完整性。圖2A各組細(xì)胞Drp1、Fis1蛋白表達(dá)的比較（***P<0.001,NS:P>0.05）

結(jié)果11圖2B電鏡下各組細(xì)胞線粒體形態(tài)的比較（黑色箭頭：線粒體結(jié)構(gòu)完整，嵴結(jié)構(gòu)清晰，白色箭頭：腫脹、空泡化的線粒體）3.SESN2過表達(dá)對Keap1/Nrf2通路的影響Westernblot分析結(jié)果顯示，與對照組相比，OGD/R組和Vector+OGD/R組胞漿Keap1蛋白水平明顯下降（P<0.001），胞核Nrf2蛋白水平升高（P<0.05），OGD/R組與Vector+OGD/R組相比，實驗結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）；與OGD/R組相比，OE-SESN2+OGD/R組胞漿Keap1蛋白水平明顯降低（P<0.05），胞核Nrf2蛋白水平明顯增加（P<0.001）見表2、圖3A，實驗結(jié)果表明氧糖剝奪/復(fù)糖復(fù)氧可使得Keap1下調(diào)而促進(jìn)Nrf2核轉(zhuǎn)位，Keap1/Nrf2通路一定程度上被激活；此外SESN2過表達(dá)明顯下調(diào)Keap1蛋白水平、促進(jìn)通路的激活；免疫熒光結(jié)果顯示，Control組Nrf2紅色熒光分布在胞漿，OGD/R組與Vector+OGD/R組除了胞漿，部分胞核內(nèi)也能觀察到Nrf2紅色熒光，而OE-SESN2+OGD/R組Nrf2紅色熒光除了胞漿，在胞核觀察到明顯聚集，見圖3B。結(jié)果進(jìn)一步表明SESN2過表達(dá)促進(jìn)Nrf2核轉(zhuǎn)位，明顯激活Keap1/Nrf2通路。


本文編號：3093788