本文關(guān)鍵詞：促進(jìn)軸突生長轉(zhuǎn)錄因子的篩選，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：神經(jīng)系統(tǒng)損傷后,受損的神經(jīng)軸突不能有效再生,致使被破壞的神經(jīng)環(huán)路無法有效重建,是阻礙神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)的最主要原因。目前對于損傷神經(jīng)元的再生修復(fù)治療策略主要集中于改善損傷區(qū)微環(huán)境,減少神經(jīng)軸突再生的不利因素;神經(jīng)干細(xì)胞的移植,新生的神經(jīng)元替代失去的神經(jīng)元,重建神經(jīng)環(huán)路;以及提高神經(jīng)元內(nèi)源性再生能力等方法。其中,提高神經(jīng)元內(nèi)源性的再生能力,是有效促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)的基本方法之一。轉(zhuǎn)錄因子(Transcription Factor,TF)是一種DNA結(jié)合蛋白,能夠與基因上特異性的位點結(jié)合從而直接或間接的調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄,在發(fā)揮基因生物功能中具有重要作用。本實驗擬通過分子和細(xì)胞生物學(xué)方法篩選多種與軸突生長相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子,并試圖將單個轉(zhuǎn)錄因子或者多個轉(zhuǎn)錄因子聯(lián)合轉(zhuǎn)染到類神經(jīng)元細(xì)胞PC12和神經(jīng)元當(dāng)中,觀察細(xì)胞突起生長情況,找出對促進(jìn)細(xì)胞突起生長有效的單個轉(zhuǎn)錄因子或轉(zhuǎn)錄因子的組合。實驗首先改造克隆及表達(dá)載體,獲得pCAGSJ載體;其次,通過文獻(xiàn)檢索,確定38種轉(zhuǎn)錄因子為候選基因,利用RT-PCR及PCR的技術(shù),獲得轉(zhuǎn)錄因子的編碼區(qū)序列(Coding DNA Sequence,CDS),并將其連接到經(jīng)過改造的真核表達(dá)載體上,經(jīng)過菌液PCR、酶切驗證和測序后確定其序列連接的正確性;最后再通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法,將38種轉(zhuǎn)錄因子分別單獨轉(zhuǎn)染到PC12細(xì)胞中,檢測細(xì)胞突起長度。結(jié)果發(fā)現(xiàn):上述轉(zhuǎn)錄因子對細(xì)胞突起的生長均起到了一定的促進(jìn)作用,但是每個轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)突起生長的能力各有不同,其中CREB、KLF4、p50、STAT3、Hb9、Batf、Sox10、Sno N、Lmx1a和Lhx3等10種轉(zhuǎn)錄因子對細(xì)胞突起生長的促進(jìn)作用最為明顯,于是我們挑選上述10種轉(zhuǎn)錄因子作為我們后續(xù)篩選促軸突生長轉(zhuǎn)錄因子組合的候選基因。然而從上述10種轉(zhuǎn)錄因子中是否能篩選出某種組合,促進(jìn)軸突生長,我們需要解決以下兩個問題:1,篩選策略;2,是否存在組合一定比單個轉(zhuǎn)錄因子效果好。于是,我們挑選了CREB、p50、STAT3和KLF4四種轉(zhuǎn)錄因子,采用N-1的策略,即4個轉(zhuǎn)錄因子,每次只轉(zhuǎn)3個,觀察哪個轉(zhuǎn)錄因子對突起生長最為有效。我們采用以下轉(zhuǎn)錄因子組合:CREB+KLF4+p50、CREB+KLF4+STAT3、CREB+p50+STAT3、KLF4+p50+STAT3。結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺少CREB和STAT3轉(zhuǎn)錄因子的組合中,細(xì)胞突起最短,說明CREB和STAT3對突起生長最為重要。隨后驗證CREB+STAT3組合效果,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后,細(xì)胞突起最長。該研究結(jié)果初步驗證我們的假設(shè):即N-1策略可以用于轉(zhuǎn)錄因子組合的篩選;存在對軸突生長最為有效的轉(zhuǎn)錄因子組合。通過改變神經(jīng)元基因表達(dá)水平的方式可以使神經(jīng)元軸突的生長能力增強(qiáng),不僅為研究神經(jīng)損傷再生修復(fù)提供了理論基礎(chǔ),而且為臨床治療神經(jīng)損傷性疾病提供了指導(dǎo)依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：神經(jīng)系統(tǒng)損傷 轉(zhuǎn)錄因子 細(xì)胞突起 內(nèi)源性
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R741
【目錄】：

• 縮略語表6-9
• 中文摘要9-11
• ABSTRACT11-13
• 前言13-14
• 文獻(xiàn)回顧14-31
• 第一部分 克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建31-41
• 1 實驗材料31-34
• 1.1 主要試劑和緩沖液31-33
• 1.2 實驗儀器、耗材33-34
• 2 實驗方法34-36
• 2.1 克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建34-36
• 2.2 表達(dá)載體pCAGSJ-EGFP的構(gòu)建及鑒定36
• 3 結(jié)果36-39
• 3.1 通過改造pCAGGS得到表達(dá)載體pCAGSJ36-39
• 3.2 表達(dá)載體pCAGSJ可以穩(wěn)定高效的表達(dá)外源基因39
• 4 討論39-41
• 第二部分 轉(zhuǎn)錄因子編碼區(qū)序列的克隆及轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)載體的構(gòu)建41-57
• 1 實驗材料41-46
• 1.1 實驗動物41
• 1.2 主要試劑和緩沖液41-42
• 1.3 引物序列42-45
• 1.4 主要儀器、耗材45-46
• 2 實驗方法46-52
• 2.1 總RNA的提取46-47
• 2.2 RNA的反轉(zhuǎn)合成cDNA47
• 2.3 常規(guī)PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄因子編碼區(qū)序列47-48
• 2.4 轉(zhuǎn)錄因子編碼區(qū)序列的回收48-51
• 2.5 轉(zhuǎn)錄因子編碼區(qū)的測序51-52
• 3 結(jié)果52-55
• 3.1 提取各組織器官的RNA52
• 3.2 通過常規(guī)PCR擴(kuò)增獲得38種轉(zhuǎn)錄因子編碼區(qū)序列52-55
• 3.3 得到38種轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)載體55
• 4 討論55-57
• 第三部分 單個轉(zhuǎn)錄因子對PC12細(xì)胞突起生長作用的評估57-75
• 1 實驗材料57-59
• 1.1 細(xì)胞系57
• 1.2 主要試劑和緩沖液57-58
• 1.3 實驗儀器和耗材58-59
• 2 實驗方法59-62
• 2.1 PC12細(xì)胞系的復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代和凍存59-60
• 2.2 無內(nèi)毒素轉(zhuǎn)錄因子的提取60-61
• 2.3 轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)染到細(xì)胞61-62
• 2.4 對轉(zhuǎn)錄因子作用后不同時間點的細(xì)胞采集圖像和定量分析62
• 3 結(jié)果62-73
• 3.1 多種轉(zhuǎn)錄因子可促進(jìn)PC12細(xì)胞突起的生長62-73
• 3.2 篩選促進(jìn)突起生長效果最為顯著的10種轉(zhuǎn)錄因子作為后續(xù)工作的研究重點73
• 4 討論73-75
• 第四部分 多種轉(zhuǎn)錄因子聯(lián)合轉(zhuǎn)染對PC12細(xì)胞突起生長作用的評估75-82
• 1 實驗材料75-76
• 1.1 細(xì)胞系75
• 1.2 主要試劑和緩沖液75
• 1.3 實驗儀器和耗材75-76
• 2 實驗方法76-77
• 2.1 PC12細(xì)胞系的復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代和凍存76
• 2.2 轉(zhuǎn)錄因子的聯(lián)合轉(zhuǎn)染76
• 2.3 聯(lián)合轉(zhuǎn)染后細(xì)胞突起長度分析76-77
• 3 結(jié)果77-80
• 3.1 三種轉(zhuǎn)錄因子聯(lián)合轉(zhuǎn)染可以更好的促進(jìn)PC12細(xì)胞突起的生長77-78
• 3.2 在CREB、Stat3、p50、Klf4四種轉(zhuǎn)錄因子中CREB+Stat3為“最優(yōu)組合”，且N-1 策略在后期實驗中可行78-80
• 4 討論80-82
• 第五部分 慢病毒包裝及感染原代神經(jīng)元對其軸突生長作用的評估82-88
• 1 實驗材料82-84
• 1.1 細(xì)胞系82
• 1.2 主要試劑和緩沖液82-83
• 1.3 實驗儀器和耗材83
• 1.4 構(gòu)建病毒載體所需引物83-84
• 1.5 慢病毒包裝84
• 2 實驗方法84-86
• 2.1 細(xì)胞的復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代和凍存84-85
• 2.2 慢病毒載體的構(gòu)建85-86
• 3 結(jié)果86
• 4 討論86-88
• 小結(jié)88-90
• 參考文獻(xiàn)90-98
• 個人簡歷和研究成果98-99
• 致謝99

  本文關(guān)鍵詞：促進(jìn)軸突生長轉(zhuǎn)錄因子的篩選，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：307092