目的:探討Akt激酶抑制劑perifosine對人膠質(zhì)瘤U251細胞凋亡、細胞周期和自噬的影響,確定perifosine誘導(dǎo)的細胞自噬與其促進膠質(zhì)瘤細胞凋亡的相關(guān)性。方法:Perifosine處理U251細胞后,采用MTT法檢測細胞活力;流式細胞術(shù)分析perifosine對U251細胞周期的影響;Annexin V-FITC/PI雙標法檢測perifosine對膠質(zhì)瘤細胞凋亡的作用;免疫印跡法檢測細胞內(nèi)P21、P27和cyclin B1等細胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白以及caspase-9、PARP等細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達水平;通過觀察細胞內(nèi)自噬標志分子LC3-II的分布與表達來確定perifosine對自噬的誘導(dǎo)作用。結(jié)果:Perifosine劑量依賴性地抑制U251細胞活力,能夠通過抑制cyclin B1的表達而阻滯膠質(zhì)瘤細胞周期于G₂期。Perifosine促進了U251細胞內(nèi)caspase-9和PARP的剪切,抑制survivin表達,從而誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細胞發(fā)生凋亡。同時,perifosine與自噬抑制劑氯喹聯(lián)用后,U251細胞凋亡數(shù)量明顯增加。結(jié)論:Perifosin... 

【文章來源】：中國病理生理雜志. 2016,32(04)北大核心

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【部分圖文】：

Perifosine誘導(dǎo)U251細胞阻滯于G2期

??4h后，GFP-LC3細胞內(nèi)的點狀分布增加，證實perifosine能夠促進膠質(zhì)瘤細胞自噬的發(fā)生，見圖6。同時，免疫印跡法檢測perifosine對人膠質(zhì)瘤細胞內(nèi)LC3-Ⅱ蛋白表達的影響，發(fā)現(xiàn)不同濃度的perifosine處理細胞后，LC3-Ⅱ蛋白表達水平明顯增多，進一步證明perifosine能夠誘導(dǎo)U251細胞發(fā)生自噬，見圖7。Figure4．Theeffectsofperifosinetreatmentatdifferentconcentrationsfor24hontheexpressionofcellcycle-associatedproteinsintheU251cells．CelllysateswereanalyzedbyWesternblot．Mean±SD．n=3．*P＜0.05vs0μmol/L．圖4Perifosine對細胞周期相關(guān)蛋白表達水平的影響表2Perifosine促進U251細胞發(fā)生凋亡Table2．PerifosineinducedU251cellapoptosis(Mean±SD．n=3)Perifosine(μmol/L)Earlyapoptoticrate(%)Lateapoptoticornecroticrate(%)02．88±0．714．67±0．92102．37±0．597．10±0．26*203．24±0．83*9．66±2．28*408．97±2．11*12．28±3．09**P＜0.05vs0μmol/L．5抑制自噬促進perifosine誘導(dǎo)的U251細胞凋亡CQ是特異性自噬抑制劑，主要抑制細胞內(nèi)自噬體和溶酶體的融合［6］。U251細胞經(jīng)CQ(10μmol/L)與perifosine(20μmol/L)聯(lián)合作用24h后，An-nexinV-FITC/PI雙標法檢測了細胞凋亡的變化。結(jié)果表明抑制自噬促進了perifosine誘導(dǎo)的U251細胞凋亡，見表3。同時免疫印跡結(jié)果顯示，自噬抑制劑CQ與perifosine聯(lián)用促進了PAＲP的切割，見圖8。·647·

Figure5．Theeffectsofperifosinetreatmentfor24hatdifferentconcentrationsonthelevelsofapoptosis-relatedproteinsintheU251cellsdeterminedbyWesternblot．Mean±SD．n=3．*P＜0.05vs0μmol/L．圖5免疫印跡檢測perifosine對U251細胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白的影響Figure6．ＲepresentativeimagesofGFP-LC3intheU251cellstransfectedwithGFP-LC3plasmid．Aftertransfectionfor24h，thecellsweretreatedwithperifosineforan-other24h．圖6Perifosine對U251細胞GFP-LC3融合蛋白表達的影響討論膠質(zhì)瘤是成人常見的惡性腦腫瘤，其侵襲性強，術(shù)后復(fù)發(fā)率高。盡管治療手段不斷進步，但中位生存期仍無明顯改進。目前膠質(zhì)瘤的治療以手術(shù)治療為主，化療則是常規(guī)的輔助治療方法，但化療藥物的獲得性耐藥使得化療效果較差，因此迫切需要尋找新的藥物來輔助膠質(zhì)瘤的手術(shù)治療。PI3K/Akt信號通路廣泛存在于細胞中，通過調(diào)節(jié)細胞周期和細胞能量代謝等多種途徑發(fā)揮重要的生理功能。研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt信號途徑在膠質(zhì)瘤中過度活化［7-8］，提示該通路與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，而PI3K和Akt激酶或許成為膠質(zhì)瘤臨床治療的有效靶點。Perifosine作為新型的Akt抑制劑，能夠通過抑制Akt和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellularsig-nal-regulatedkinase1/2，EＲK1/2)的磷酸化而抑制小·648·


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