本文關(guān)鍵詞：腺苷預(yù)處理星形膠質(zhì)細(xì)胞氧糖剝奪復(fù)氧糖后CX3CL1、GLT-1表達(dá)的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的通過體外分離、純化及鑒定SD大鼠來源的星形膠質(zhì)細(xì)胞(Astrocyte As)的方法,建立氧糖剝奪/復(fù)氧糖模型,探討缺氧復(fù)氧情況下,腺苷預(yù)處理誘導(dǎo)趨化因子(CX3CL1)、星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白(GLT-1)的表達(dá)情況,為臨床治療缺血性腦血管疾病奠定基礎(chǔ)。方法1.體外培養(yǎng)SD大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞,根據(jù)星形膠質(zhì)細(xì)胞在皮層分布的特點(diǎn),取出生24h內(nèi)的SD大鼠,剝離其腦膜和血管,通過機(jī)械吹打法和差速貼壁的發(fā)法處理及進(jìn)行細(xì)胞傳代。用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變。2.對(duì)培養(yǎng)至第三代或第四代的星形膠質(zhì)細(xì)胞通過免疫熒光法行膠質(zhì)纖維酸性蛋白酶GFAP的鑒定。3.在24孔板內(nèi),將融合80%以上的第三代星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行傳代,隨機(jī)分為正常組、模型組(OGD/R)及腺苷預(yù)處理組(ADO/R)。24h后細(xì)胞基本貼壁,且伸出突觸,貼壁后ADO/R組給予腺苷預(yù)處理,即用含100μM腺苷的DMEM預(yù)先處理細(xì)胞,24h后進(jìn)行氧糖剝奪過程。正常組不進(jìn)行此過程,OGD/R組和ADO/R組在糖氧剝奪期均更換為無(wú)糖DMEM培養(yǎng)基,把培養(yǎng)板蓋去掉,放入缺氧培養(yǎng)箱(含95%氮?dú)狻?%CO2)的中孵育。缺氧進(jìn)行5h后,OGD/R組和ADO/R組均更換為復(fù)糖DMEM培養(yǎng)基,移入正常細(xì)胞培養(yǎng)箱(含37℃、5%CO2)內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24h。正常組細(xì)胞在正常培養(yǎng)箱(含37℃、5%CO2)中孵育。用光學(xué)顯微鏡觀察各組細(xì)胞氧糖剝奪復(fù)氧糖后的形態(tài)學(xué)變化。4.在96孔板內(nèi),以1×105個(gè)/mL的密度接種第3代星形膠質(zhì)細(xì)胞,每孔為104個(gè)細(xì)胞數(shù),待24h后細(xì)胞融合后,經(jīng)過氧糖剝奪處理后,用MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞的活力。5. 在24孔板中接種上對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞,細(xì)胞融合后,棄掉培養(yǎng)液,然后隨機(jī)分組,各組細(xì)胞經(jīng)氧糖剝奪處理后,在相應(yīng)的各孔中加入1000gL培養(yǎng)基,在復(fù)氧復(fù)糖24h后,將各組細(xì)胞上清液收集出來,按照大鼠CX3CL1 ELISA試劑盒測(cè)定CX3CL1濃度。在450nm波長(zhǎng)下,用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度OD值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品大鼠CX3CL1的濃度。6.用免疫熒光法檢測(cè)各組GLT-1的表達(dá)情況。7. 用Western blot的方法測(cè)GLT-1的表達(dá)水平。將各組氧糖剝奪復(fù)氧糖后的細(xì)胞進(jìn)行消化,在加蛋白裂解液,冰上裂解20分鐘,蛋白濃度測(cè)定后在加上樣緩沖液,經(jīng)過沸水變性5分鐘,在每孔中加40ug蛋白樣品進(jìn)行電泳,用PVDH膜轉(zhuǎn)膜,封閉以后經(jīng)1：500的稀釋比例加入一抗,在4度冰箱過夜后,加HRP標(biāo)記的二抗,37度孵育箱內(nèi)孵育1h,經(jīng)ECL顯影后,用GAPDH做內(nèi)參進(jìn)行對(duì)照,各組熒光條帶的吸光度值用ImageJ軟件分析。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析目的蛋白GLT-1與內(nèi)參的比值。8. 數(shù)據(jù)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)來表示,用Spss17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,組間比較采用單因素方差進(jìn)行分析,用Turkey法行兩兩比較,采用a=0.05的檢驗(yàn)水準(zhǔn)。結(jié)果1.成功培養(yǎng)原代星形膠質(zhì)細(xì)胞。2.氧糖剝奪5h復(fù)氧糖24h后星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變：正常組星形膠質(zhì)細(xì)胞氧糖剝奪復(fù)氧糖24h后生長(zhǎng)狀態(tài)良好,與之前相比無(wú)明顯的形態(tài)學(xué)改變；OGD/R組星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體因水腫變圓,形狀由不規(guī)則形變?yōu)樗笮?突起明顯變短或消失；ADO/R組細(xì)胞有較輕的水腫改變。3.MXT法細(xì)胞活性檢測(cè)表明：經(jīng)氧糖剝奪復(fù)氧糖24h后,OGD/R組細(xì)胞活性明顯下降；與正常組相比,OD值降低(P0.05),說明細(xì)胞的活力下降是由細(xì)胞損傷或死亡引起的。較OGD/R組,ADO/R組細(xì)胞活力較高,說明細(xì)胞活力受ADO影響(P0.05)。且兩兩比較有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)4.細(xì)胞培養(yǎng)液中CX3CL1的測(cè)定結(jié)果顯示：氧糖剝奪復(fù)氧糖24h后細(xì)胞培養(yǎng)液中CX3CL1濃度測(cè)定表明,OGD/R組星形膠質(zhì)細(xì)胞CX3CL1濃度顯著高于正常組(P0.05),表明細(xì)胞缺氧缺糖損傷嚴(yán)重,釋放出大量的CX3CL1; ADO/R組與OGD/R組相比,CX3CL1濃度明顯降低(P0.05),表明細(xì)胞損傷較OGD/R組輕,CX3CL1的釋放量較少。比較細(xì)胞培養(yǎng)液中CX3CL1濃度,三組間兩兩比較有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。5.GLT-1免疫熒光結(jié)果顯示：正常組的胞膜與胞質(zhì)中熒光信號(hào)表達(dá)最強(qiáng)；經(jīng)氧糖剝奪復(fù)糖氧后,OGD/R組胞膜熒光信號(hào)表達(dá)減弱；而胞質(zhì)中熒光強(qiáng)度表達(dá)弱且無(wú)顯著的變化。與OGD/R組相比,ADO/R組胞膜熒光強(qiáng)度降低但顯著高于OGD/R組。6. Westernblot檢測(cè)氧糖剝奪/復(fù)糖后GLT-1的表達(dá)情況顯示：正常組星形膠質(zhì)細(xì)胞在氧糖剝奪5h/復(fù)氧糖24h后GLT-1蛋白表達(dá)相對(duì)最高,ADO/R組次之,OGD/R組最低,三組間兩兩比較有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)結(jié)論1.星形膠質(zhì)細(xì)胞在氧糖剝奪復(fù)氧糖后受損嚴(yán)重；2.星形膠質(zhì)細(xì)胞的損傷程度與其活性、CX3CL1的表達(dá)濃度呈對(duì)應(yīng)變化的關(guān)系；3.腺苷預(yù)處理可減少氧糖剝奪復(fù)氧糖后星形膠質(zhì)細(xì)胞的損傷程度,并使氧糖剝奪/復(fù)氧糖后谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白GLT-1的表達(dá)水平升高,從而增強(qiáng)了大腦對(duì)缺血再灌注損傷的耐受程度。
【關(guān)鍵詞】：CX3CL1 GLT-1 星形膠質(zhì)細(xì)胞 氧糖剝奪復(fù)氧糖
【學(xué)位授予單位】：新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R743
【目錄】：

• 摘要5-8
• Abstract8-11
• 前言11-13
• 1 實(shí)驗(yàn)材料與方法13-28
• 2 結(jié)果28-30
• 3 討論30-35
• 4 結(jié)論35-36
• 附圖36-40
• 參考文獻(xiàn)40-43
• 綜述：腦缺血再灌注損傷的機(jī)制及腺苷的保護(hù)作用43-52
• 參考文獻(xiàn)48-52
• 附錄52-53
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表文章情況53-54
• 致謝54-55
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷55

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前5條

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中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

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  本文關(guān)鍵詞：腺苷預(yù)處理星形膠質(zhì)細(xì)胞氧糖剝奪復(fù)氧糖后CX3CL1、GLT-1表達(dá)的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：301862