帕金森氏�。≒arkinson’s disease, PD）主要是因位于中腦“黑質(zhì)”部位的細胞發(fā)生病理性改變后中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元（dopaminergic neuron, DA neuron）緩慢發(fā)生選擇性死亡或紋狀體多巴胺含量顯著減少引起的。由于PD發(fā)生的根本原因是多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量的劇減導(dǎo)致其釋放的DA遞質(zhì)含量不足,因此,對DA神經(jīng)元分化的調(diào)控研究具有潛在的醫(yī)學(xué)研究意義和臨床應(yīng)用價值。Nr4a2/Nurrl是超家族轉(zhuǎn)錄因子的成員之一,它在腹側(cè)中腦及中腦多巴胺神經(jīng)元中高表達。已有研究報道Nr4a2/Nurrl （nuclear receptor-related factor1）是細胞核受體相關(guān)因子1,與多巴胺能神經(jīng)元的發(fā)生具有密切聯(lián)系,是決定多巴胺神經(jīng)元的發(fā)育和分化的一個最重要的轉(zhuǎn)錄因子之一。目前,有文獻報道m(xù)icro RNAs（miRNAs）對多巴胺能神經(jīng)元分化的轉(zhuǎn)錄子Nr4a2/Nurrl具有表達調(diào)控的作用。micro RNAs（miRNAs）是一類長度約為20-25nt的內(nèi)源性單鏈非編碼RNA,主要在轉(zhuǎn)錄后水平參與基因調(diào)控,在各種生命活動中起重要作用。因此,系統(tǒng)研究micr... 

【文章來源】：南昌大學(xué)江西省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：94 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第1章 引言
    1.1 選題背景和研究意義
    1.2 帕金森氏病的介紹
        1.2.1 帕金森氏病的發(fā)病機制及病理特征
    1.3 多巴胺及多巴胺能神經(jīng)元
    1.4 NR4A2/NURR1與多巴胺能神經(jīng)元
    1.5 MICRORNA簡介及作用機制
    1.6 MIRNA在多巴胺能神經(jīng)元的生物學(xué)作用
    1.7 MIRNA對帕金森氏病的影響
    1.8 多巴胺能神經(jīng)元的分化研究進展
第2章 材料與方法
    2.1 儀器和設(shè)備
        2.1.1 儀器和設(shè)備
        2.1.2 試劑和耗材
        2.1.3 引物序列
        2.1.4 質(zhì)粒構(gòu)建
        2.1.5 動物、細胞和質(zhì)粒
第3章 實驗方法
    3.1 實驗總思路
    3.2 293T細胞培養(yǎng)
        3.2.1 293T細胞復(fù)蘇
        3.2.2 293T細胞的傳代
    3.3 小鼠神經(jīng)干細胞（NPC）培養(yǎng)
        3.3.1 小鼠神經(jīng)干細胞（NPC）原代培養(yǎng)
        3.3.2 小鼠神經(jīng)干細胞（NPC）傳代培養(yǎng)
        3.3.3 神經(jīng)干細胞克隆球染色（干性鑒定）
    3.4 MEF飼養(yǎng)層的制作
        3.4.1 MEF細胞的獲得
        3.4.2 MEF細胞傳代培養(yǎng)
        3.4.3 MEF細胞γ射線處理
    3.5 ES細胞培養(yǎng)
        3.5.1 ES細胞復(fù)蘇
        3.5.2 ES細胞傳代培養(yǎng)
    3.6 LUCIFERASE檢測
        3.6.1 293T細胞的傳代培養(yǎng)
        3.6.2 miRNA與靶基因NR4A2共轉(zhuǎn)染
        3.6.3 Luciferlase檢測
    3.7 LENTI-MIRNA分子克隆構(gòu)建
        3.7.1 質(zhì)粒提取
        3.7.2 Top質(zhì)粒、lenti載體酶切和酶連
        3.7.3 轉(zhuǎn)化和挑克隆搖菌
        3.7.4 測序和比對
        3.7.5 保種
        3.7.6 中提質(zhì)粒
    3.8 慢病毒轉(zhuǎn)染與感染
        3.8.1 病毒轉(zhuǎn)染
        3.8.2 病毒感染
    3.9 WESTERN BLOTTING檢測靶基因NR4A2表達
        3.9.1 細胞收集、蛋白提取及測定
        3.9.2 Western Blotting蛋白檢測NR4A2蛋白表達
    3.10 Q-PCR檢測目的基因的NR4A2表達
        3.10.1 RNA提取
        3.10.2 RT-PCR（逆轉(zhuǎn)錄PCR）
    3.11 小鼠ES向多巴胺能神經(jīng)元的自發(fā)分化
    3.12 ES向多巴胺能神經(jīng)元的誘導(dǎo)分化
    3.13 QPCR檢測ES向多巴胺能神經(jīng)元分化結(jié)束后基因的表達
    3.14 胚胎中腦干細胞向多巴胺能神經(jīng)元的誘導(dǎo)分化
第4章 結(jié)果與分析
    4.1 LUCIFERASE檢測
        4.1.1 293T細胞的貼壁培養(yǎng)
        4.1.2 Luciferase檢測
    4.2 LENTI-MIRNA克隆構(gòu)建
    4.3 慢病毒包裝轉(zhuǎn)染293T細胞
    4.4 NPC克隆球染色鑒定
        4.4.1 NPC細胞懸浮培養(yǎng)
        4.4.2 NPC克隆球干性鑒定
    4.5 病毒感染NPC
        4.5.1 NPC貼壁培養(yǎng)
        4.5.2 病毒感染
    4.6 NR4A2的WESTERN BLOTTING檢測
    4.7 NR4A2的REAL-TIME-PCR檢測
    4.8 ES分化
        4.8.1 ES培養(yǎng)
        4.8.2 懸EB球（擬胚體）
        4.8.3 ES自發(fā)分化
        4.8.4 多巴胺能神經(jīng)元的誘導(dǎo)分化
    4.9 ES細胞向多巴胺能神經(jīng)元分化的REAL-TIME-PCR檢測
    4.10 中腦干細胞誘導(dǎo)分化多巴胺能神經(jīng)元
第5章 討論
    5.1 EB球貼壁感染病毒后出現(xiàn)的問題
    5.2 分化效率不穩(wěn)定的原因
    5.3 純化多巴胺能神經(jīng)元
    5.4 MIRNAs對多巴胺能神經(jīng)元分化影響的結(jié)果分析
    5.5 MIRNAs作為新興生物藥物治療帕金森疾病的展望
致謝
參考文獻



本文編號：2996379