1.肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥（Amyorophic Lateral Sclerosis, ALS）是一種致命的神經(jīng)退行性疾病,研究表明一部分原因是由于SOD1的突變產(chǎn)生了聚集。SOD1作為Cu2+結(jié)合蛋白在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)濃度很高,同時由于Cu具有強(qiáng)氧化性,因此我們將研究是否不正常的Cu2+濃度能解釋SOD1突變體導(dǎo)致的ALS疾病。我們研究了Cu2+在誘導(dǎo)病理型突變體A4V和氧化的WT SOD1產(chǎn)生聚集方面的作用。研究首次表明Cu2+對A4V的氧化修飾主要發(fā)生在第111位半胱氨酸上。A4V與Cu2+的結(jié)合主要有兩個位點(diǎn)：一個中等親和力的結(jié)合位點(diǎn)（186nM）和一個較高親和力的結(jié)合位點(diǎn)（1.83nM）。高濃度的Cu2+不僅可以誘導(dǎo)A4V的氧化修飾,同時也引發(fā)A4V蛋白的快速聚集。研究發(fā)現(xiàn)Cu2+與氧化型WT SOD1的結(jié)合和引發(fā)氧化型WT蛋白的聚集方面與Cu2+和A4V的方式基本相似。所以我們表明不正常的Cu2+作用解釋了SOD1突變體誘發(fā)家族性ALS和偶發(fā)性ALS疾病方面具有重要作用。2.由SOD1（human copper, zinc superoxide dismutase）,即銅鋅超氧化... 

【文章來源】：武漢大學(xué)湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
第一章 前言
    1.1 神經(jīng)退行性疾病
        1.1.1 神經(jīng)退行性疾病種類
        1.1.2 神經(jīng)退行性疾病的病理機(jī)制
    1.2 肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥（ALS）
        1.2.1 家族性ALS（fALS）
        1.2.2 偶發(fā)性ALS（sALS）
    1.3 SOD1和ALS
        1.3.1 SOD1
            1.3.1.1 SOD1結(jié)構(gòu),折疊和穩(wěn)定性
            1.3.1.2 SOD1纖維化：二硫鍵和金屬離子共同作用的結(jié)果
        1.3.2 SOD1—ALS致病原因
            1.3.2.1 銅鋅超氧化物歧化酶的氧化修飾
            1.3.2.2 SOD1突變體與Cu的親和力增加
            1.3.2.3 SOD1半胱氨酸氧化作用導(dǎo)致蛋白出現(xiàn)單體化
            1.3.2.4 半胱氨酸氧化修飾的SOD1形成氧化壓力
        1.3.3 野生型SOD1在ALS疾病中的作用
    1.4 展望
    1.5 研究方法
        1.5.1 熒光光譜
        1.5.2 90°光散射
        1.5.3 透射電鏡（TEM）
        1.5.4 等溫滴定量熱技術(shù)
    1.6 課題的研究意義
        1.6.1 銅對SOD1的氧化修飾及對SOD1聚集的影響
        1.6.2 WT SOD1在ALS疾病中的作用
第二章 銅離子介導(dǎo)SOD1的氧化修飾,引發(fā)SOD1的聚集
    摘要
    引言
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料與方法
        2.1.1 材料
        2.1.2 試劑——緩沖液
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)方法
            2.1.3.1 質(zhì)粒（PET3d）
            2.1.3.2 野生型human-SOD1的表達(dá)、提取與純化
            2.1.3.3 Human-SODl突變體（C111S）的表達(dá)與純化
            2.1.3.4 突變體A4V-SOD1的表達(dá)、提取與純化
            2.1.3.5 銅鋅超氧化物歧化酶脫輔基的過程
            2.1.3.6 檢測蛋白的聚集
            2.1.3.7 原子力顯微鏡檢測聚集體
            2.1.3.8 Nano-LC-MS/MS的檢測
            2.1.3.9 高效液相色譜（HPLC）
            2.1.3.10 等溫滴定量熱（ITC）
    2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
2+作用下,SOD1突變體A4V比野生型SOD1聚集的更快,更嚴(yán)重">        2.2.1 在較高的Cu²⁺作用下,SOD1突變體A4V比野生型SOD1聚集的更快,更嚴(yán)重
2+作用下,SOD1突變體A4V聚集體的形態(tài)">        2.2.2 原子力顯微鏡檢測在較高的Cu²⁺作用下,SOD1突變體A4V聚集體的形態(tài)
2H,磺酸化C-SO₃">        2.2.3 A4V在高Cu條件出現(xiàn)111位半胱氨酸的氧化修飾(亞磺酸化C-SO₂H,磺酸化C-SO3

        2.2.4 較高的Cu離子不僅能夠誘導(dǎo)氧化修飾的A4V聚集,也會帶動非氧化的A4V現(xiàn)聚集
        2.2.5 較高的Cu離子誘導(dǎo)氧化的野生型SOD1聚集
        2.2.6 A4V和氧化的野WT SOD1與Cu具有相似的結(jié)合模式
    2.3 本章討論
第三章 野生型超氧化物歧化酶在超氧化物歧化酶突變體聚集過程中的重要作用
    摘要
    前言
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料和方法
        3.1.1 材料和試劑
        3.1.2 實(shí)驗(yàn)緩沖液
        3.1.3 Human-SOD1幾種突變體（C111S、A4V、G93A、S134N）的表達(dá)與純化
            3.1.3.1 生理?xiàng)l件下蛋白產(chǎn)生聚集
            3.1.3.2 ThT熒光法檢測SOD1聚集體的產(chǎn)生
            3.1.3.3 紫外濁度檢測
            3.1.3.4 電鏡檢測聚集體的形態(tài)
            3.1.3.5 ANS外源熒光檢測蛋白疏水區(qū)暴露
            3.1.3.6 Edman測序
            3.1.3.7 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果分析
    3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.2.1 在三氟乙酸（TFE）條件下,突變體A4V/S134N帶動野生型SOD1產(chǎn)生聚集
        3.2.2 在生理?xiàng)l件下,突變體A4V帶動WT SOD1產(chǎn)生聚集
        3.2.3 檢測SOD1s在不同條件下產(chǎn)生的聚集體的形態(tài)
        3.2.4 混合體系產(chǎn)生的聚集體內(nèi)存在WT SOD1
        3.2.5 游離半胱氨酸（第6和111位）在蛋白聚集中起了重要作用
    3.3 本章討論
2O₂誘導(dǎo)WT SOD1產(chǎn)生纖維樣聚集">第四章 H₂O₂誘導(dǎo)WT SOD1產(chǎn)生纖維樣聚集
    摘要
    引言
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料與方法
        4.1.1 材料見第二章
        4.1.2 實(shí)驗(yàn)方法
            4.1.2.1 野生型human-SOD1的表達(dá)、提取與純化（見第二章）
            4.1.2.2 檢測蛋白的聚集
            4.1.2.3 原子力顯微鏡檢測聚集體
            4.1.2.4 透射電鏡檢測聚集體
            4.1.2.5 Nano-LC-MS/MS的檢測
            4.1.2.6 CPD熒光探針檢測半胱氨酸的次磺酸化反應(yīng)
    4.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
2O₂,WT SOD1產(chǎn)生纖維樣的聚集體">        4.2.1 病理濃度的H₂O₂,WT SOD1產(chǎn)生纖維樣的聚集體
2O₂條件下也會出現(xiàn)氧化修飾（-SO₂H）">        4.2.2 111位半胱氨酸在較低的H₂O₂條件下也會出現(xiàn)氧化修飾（-SO₂H）
2O₂誘導(dǎo)WT SOD1產(chǎn)生聚集的過程中111位半胱氨酸具有重要作用">        4.2.3 較低的H₂O₂誘導(dǎo)WT SOD1產(chǎn)生聚集的過程中111位半胱氨酸具有重要作用
        4.2.4 111位半胱氨酸形成分子間的二硫鍵起始WT SOD1的聚集
    4.3 本章討論
參考文獻(xiàn)
攻讀博士學(xué)位期間待發(fā)表的論文目錄
致謝



本文編號：2979241

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