目的構(gòu)建插入EA-IL-15雙基因的溶瘤腺病毒（oAD-EA-IL-15）,探討其在體外對膠質(zhì)瘤細胞的殺傷效果和特異性。方法 PCR法將EA-IL-15雙基因插入腺病毒穿梭載體pXC1,將穿梭質(zhì)粒pXC1-EA-IL-15及輔助質(zhì)粒pBHG loxΔE1,3 Cre質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK393細胞,獲得溶瘤腺病毒oAD-EA-IL-15。通過CCK-8細胞毒性實驗,測定細胞相對活性,繪制劑量反應(yīng)曲線。結(jié)果成功構(gòu)建溶瘤腺病毒載體（oAD）及含EA-IL-15雙基因的溶瘤腺病毒載體（oAD-EA-IL-15）;體外包裝獲得相應(yīng)的溶瘤腺病毒oAD和oAD-EA-IL-15;oAD對小鼠膠質(zhì)瘤細胞GL261有明顯殺傷作用（P<0.05）,對小膠質(zhì)細胞BV2（非腫瘤細胞）的殺傷作用明顯低于對GL261（P<0.05）,說明oAD具有特異性;oAD-EA-IL-15和oAD分別感染GL261、BV2細胞,對于GL261,oAD-EA-IL-15的半抑制濃度(IC₅₀)值為0.58×10⁷±1.30×10⁵ PFU/ml較oAD... 

【文章來源】：醫(yī)學(xué)研究雜志. 2020,49(10)

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圖6 雙基因溶瘤腺病毒特異性分析

2.溶瘤腺病毒oAD對膠質(zhì)瘤細胞的體外殺傷作用及特異性研究:溶瘤腺病毒oAD感染膠質(zhì)瘤細胞GL261,72h后倒置顯微鏡下觀察,可見對照組細胞貼壁生長,排列規(guī)則,細胞密度大。實驗組中隨著MOI值的增高,細胞密度減少,細胞形態(tài)皺縮,詳見圖1。說明oAD對GL261細胞有一定的殺傷作用。將oAD同時作用于GL261細胞及小膠質(zhì)細胞BV2(非腫瘤細胞)。感染72h后測定細胞相對活性,可以看到與對照組(PBS)比較,oAD對GL261具有明顯的殺傷作用(P<0.05),并且在不同MOI值病毒的作用下,oAD對GL261的殺傷作用明顯高于對BV2,兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),詳見圖2。圖2 空載溶瘤腺病毒(oAD)特異性及有效性分析

圖1 倒置顯微鏡下觀察空載溶瘤腺病毒(oAD)對膠質(zhì)瘤細胞GL261形態(tài)的影響(×100)3.構(gòu)建插入EA-IL-15雙基因的溶瘤腺病毒(oAD-EA-IL-15):為了增強溶瘤病毒對膠質(zhì)瘤細胞的殺傷作用,筆者將Endo-Angio及IL-15基因定向克隆構(gòu)建到溶瘤腺病毒oAD的腺病毒穿梭載體pXC1中,構(gòu)建成EA-IL-15雙基因腺病毒載體pXC1-EA-IL-15。PCR的方法檢測所插入的基因,可見挑取的8個克隆株中有7個攜帶有EA-IL-15基因,詳見圖3。Endo-Angio基因和IL-15基因中間通過核糖體進入位點(IRES)連接,可同時表達,詳見圖4。筆者進一步將穿梭質(zhì)粒pXC1- EA-IL-15及輔助質(zhì)粒pBHG loxΔE1, 3Cre質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK393細胞,得到溶瘤腺病毒oAD-EA-IL-15。


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