脊髓性肌萎縮癥（Spinal Muscular Atrophy，SMA）是一種高發(fā)病率并導(dǎo)致嬰兒致死的常染色體隱形神經(jīng)肌肉障礙疾病。導(dǎo)致這種疾病的遺傳學(xué)原因是純和的丟失SMN1基因。但其同源的SMN2有外顯子7上6位的C到T的突變導(dǎo)致其不剪接，產(chǎn)生截短的且不穩(wěn)定的SMN蛋白，不能補(bǔ)償全長(zhǎng)的SMN蛋白的功能。所以說(shuō)，增加SMN2外顯子7的剪接目前被認(rèn)為是可行、有效的方法來(lái)治療脊髓性肌萎縮癥。因此，SMN2外顯子7的可變剪接調(diào)控的研究變得尤為重要。本論文通過(guò)初步的RNA干擾鑒定出了新的SMN2外顯子7剪接的抑制因子-hnRNP U，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)了hnRNP U的一項(xiàng)新功能-可變剪接調(diào)控因子，因?yàn)槟壳皼](méi)有報(bào)道發(fā)現(xiàn)hnRNP U參與調(diào)控可變剪接。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)它既調(diào)控SMN2外顯子7剪接，也調(diào)控SMN1外顯子7剪接，并不響應(yīng)SMN2外顯子7上C到T的突變位點(diǎn)。深入研究后發(fā)現(xiàn)重組的hnRNP U在體外并不結(jié)合SMN2外顯子7和它附近的內(nèi)含子RNA，但是在體內(nèi)結(jié)合SMN2pre-mRNA。它的作用方式即不依賴于已知的內(nèi)含子剪接抑制元件，也與該基因的轉(zhuǎn)錄速率無(wú)關(guān)。這暗示hnRNP U可能通過(guò)以前未被發(fā)現(xiàn)的... 

【文章來(lái)源】：武漢大學(xué)湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 引言
    1. 可變剪接調(diào)控的介紹
        1.1 前體 RNA 可變剪接
        1.2 剪接位點(diǎn)的識(shí)別和選擇
        1.3 幫助剪接位點(diǎn)識(shí)別
        1.4 抑制剪接位點(diǎn)識(shí)別
        1.5 位置依賴性的剪接調(diào)控
        1.6 RNA 結(jié)構(gòu)在可變剪接調(diào)控中的作用
        1.7 蛋白因子調(diào)控可變剪接
        1.8 轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)的可變剪接調(diào)控
        1.9 可變剪接和組織特異性
        1.10 組成型剪接調(diào)控因子調(diào)控可變剪接
        1.11 可變剪接與人類疾病
        1.12 展望
    2. SMA 和 SMN 的介紹
        2.1 SMA 疾病的介紹
        2.2 SMA 疾病相關(guān)的 SMN2 外顯子 7 可變剪接的機(jī)制
        2.3 SMA 的治療方面的進(jìn)展
    3. hnRNP U 的介紹
    4. 本課題的研究?jī)?nèi)容及意義
        4.1 課題研究的內(nèi)容
        4.2 課題的研究意義
第二章 材料和方法
    1. 材料
        1.1 菌株、質(zhì)粒及細(xì)胞系
        1.2 生化藥品及來(lái)源
        1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及操作相關(guān)的試劑
        1.4 酶類和 DNA marker，蛋白 marker
        1.5 抗體及其相關(guān)
        1.6 ssRNA 和 siRNA 合成
        1.7 本研究所用引物
        1.8 分析軟件和網(wǎng)絡(luò)資源
        1.9 圖像編輯軟件
        1.10 儀器
    2. 溶液的配制
        2.1 細(xì)菌用抗生素的配制
        2.2 蛋白純化中所用的緩沖液
        2.3 DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基的配制
        2.4 細(xì)胞專用 PBS 的制備
        2.5 細(xì)胞專用胰酶的配制
        2.6 免疫沉淀及免疫印跡相關(guān)溶液的配方
    3. 方法
        3.1 E. coli RNase III 的制備和純化
        3.2 人類 RNA 結(jié)合蛋白 esiRNA 庫(kù)的制備
        3.3 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染
        3.4 免疫印跡
        3.5 RT-PCR
        3.6 Trizol 中提取蛋白
        3.7 突變克隆
        3.8 克隆的構(gòu)建
        3.9 免疫共沉淀
        3.10 RIP-PCR
        3.11 免疫共定位
        3.12 CLIP-seq 實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng)
        3.13 RNA-seq
第三章 結(jié)果與討論
    1. RNAi 篩選發(fā)現(xiàn) HnRNP U 是一個(gè)新的抑制 SMN2 可變外顯子 7 剪接的剪接調(diào)控因子。
    2.hnRNP U 沉默同樣會(huì)增強(qiáng) SMN1 的剪接，暗示 hnRNP U 不是通過(guò)靶向外顯子 7 的 C 到 T 變化所產(chǎn)生的 ESS 而起作用的
    3. hnRNP U 抑制 SMN2 的剪接不依賴于任何已知的 ISS
    4. hnRNP U 可能不是通過(guò)影響轉(zhuǎn)錄延伸來(lái)抑制 SMN 外顯子７的剪接的
    5. hnRNP U 在體外不與 SMN2 外顯子 7 及附近的內(nèi)含子 RNA 結(jié)合，而在細(xì)胞內(nèi)結(jié)合 SMN2 轉(zhuǎn)錄本
    6. 大規(guī)模篩選人類 RNA 結(jié)合蛋白發(fā)現(xiàn)了另外 8 個(gè)新的抑制 SMN2 外顯子 7 剪接的蛋 白質(zhì)，其中 5 個(gè)是與 U2 snRNP 相互作用的蛋白
    7. hnRNP U 與 U2AF65/35 通過(guò) RNA 依賴的方式相互結(jié)合，并協(xié)同調(diào)控 SMN2 外顯 子 7 的剪接
    8. CLIP 鑒定 hnRNP U 結(jié)合的 RNA 靶標(biāo)
    9. hnRNP U 結(jié)合 U2 snRNA，證明它是 U2 snRNP 的一個(gè)重要組分
第四章 研究工作總結(jié)和展望
參考文獻(xiàn)
研究生期間發(fā)表或待發(fā)表論文
致謝
縮寫(xiě)索引



本文編號(hào)：2964117