[目的]本研究擬通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探明coronin3表達(dá)量的變化,對(duì)U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的影響。[方法]①p EGFP/coronin3真核過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定:在無(wú)菌、無(wú)RNA酶污染的條件下利用RNA提取試劑盒提取出U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞的總RNA。利用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）擴(kuò)增出coronin3基因的片段,瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)束后回收純化PCR產(chǎn)物,提取大腸桿菌質(zhì)粒,瓊脂糖凝膠電泳回收產(chǎn)物與空白質(zhì)粒pEGFP-N2,將目的基因與質(zhì)粒同時(shí)進(jìn)行XhoI和BamhI雙酶切,兩種酶切產(chǎn)物經(jīng)solution I連接酶作用后,轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌DH5α,LB瓊脂平板培養(yǎng)過(guò)夜。經(jīng)菌落PCR初篩,陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒后送昆明碩擎生物技術(shù)服務(wù)有限公司堿基測(cè)序,將堿基測(cè)序結(jié)果報(bào)告與ncbi.Blast軟件進(jìn)行同源性對(duì)比分析。②U87細(xì)胞的轉(zhuǎn)染和重組基因p EGFP/coronin 3蛋白以及GFP的表達(dá)及檢測(cè):取純化的重組質(zhì)粒p EGFP/coronin 3和空質(zhì)粒GFP,在脂質(zhì)體試劑viafect的作用下轉(zhuǎn)染U87細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞,Western blot鑒定重組coronin... 

【文章來(lái)源】：昆明醫(yī)科大學(xué)云南省

【文章頁(yè)數(shù)】：61 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖１．目的基因ＰＣＲ后瓊脂糖凝膠電泳分析??目的基因大小約為１４１３?ｂｐ，由圖１可見(jiàn)，在１５００?ｂｐ的位置存在一條明亮的條??帶

４７＿?—??圖２．質(zhì)粒ＤＮＡ瓊脂糖凝膠電泳分析??質(zhì)粒ＤＮＡ大小約為４７００?ｂｐ，由圖２可見(jiàn)，在大約４７００?ｂｐ的位置存在一條明亮??的條帶。??２５??

酶切后的質(zhì)粒大小約為４６００ｂｐ，酶切后的目的基因大小約為１４００ｂｐ，因此在酶切??后質(zhì)粒的泳道上在大約４６００ｂｐ左右的位置可見(jiàn)明亮條帶，在酶切目的基因的泳??道上在大約１４００ｂｐ左右的位置可見(jiàn)明亮條帶。??圖４．成功轉(zhuǎn)化的菌落?圖５．單克隆菌落??ｍａｋｅｒ?陽(yáng)性結(jié)果?陰性對(duì)照??

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Coronin 1c與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)性研究進(jìn)展[J]. 范麗媛,李寶生,魏玉梅.  中華腫瘤防治雜志. 2017(12)



本文編號(hào)：2959307