在實驗性病理條件下,紋狀體與皮層等非神經(jīng)發(fā)生區(qū)存在神經(jīng)元新生。大量研究顯示缺血損傷能誘導(dǎo)梗塞周邊區(qū)發(fā)生血管增生和神經(jīng)元新生。在大鼠腦內(nèi)過表達(dá)或注射血管生成蛋白VEGF能同時增加缺血損傷腦內(nèi)的血管增生和神經(jīng)元新生。本實驗通過紋狀體注射pTIE2-GFP質(zhì)粒示蹤GFP免疫陽性（GFP+）內(nèi)皮來源細(xì)胞的分化,研究血管增生在缺血誘導(dǎo)神經(jīng)元新生中的作用。并通過側(cè)腦室注射VEGF表達(dá)質(zhì)粒和對照質(zhì)粒觀察過表達(dá)VEGF對MCAO術(shù)后大鼠缺血紋狀體內(nèi)血管增生與神經(jīng)元新生的作用。隨后,采用免疫熒光多標(biāo)記與激光共聚焦掃描技術(shù)檢測缺血腦內(nèi)血管增生、神經(jīng)元新生與膠質(zhì)增生的變化。最后,結(jié)合免疫熒光多標(biāo)記與全細(xì)胞膜片鉗記錄進(jìn)一步分析缺血腦內(nèi)GFP+細(xì)胞形態(tài)學(xué)和電生理學(xué)特性。研究顯示,缺血誘導(dǎo)的增生內(nèi)皮細(xì)胞（GFP+）能表達(dá)不同類型神經(jīng)元標(biāo)記物并具有動作電位發(fā)放。實驗結(jié)果總結(jié)如下：1.缺血腦內(nèi)內(nèi)皮源性和不同發(fā)育時期神經(jīng)元性蛋白呈時間依賴的表達(dá)免疫組化結(jié)果顯示,MCAO術(shù)后3天至2周大鼠缺血紋狀體內(nèi)vWF、nestin、DCX與Tuj-1呈現(xiàn)時間依賴的表達(dá)。缺血側(cè)紋狀體內(nèi)vWF+細(xì)胞在缺血再灌3天顯著增加,再灌1周和2... 

【文章來源】：復(fù)旦大學(xué)上海市 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：83 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
目錄
縮略語表（按字母順序）
中文摘要
英文摘要（Abstract）
（一） 前言
（二） 材料與方法
    1. 實驗動物與分組
    2. 試劑來源
    3. 儀器設(shè)備
    4. 實驗方法
        4.1 大鼠左側(cè)大腦中動脈線栓（MCAO）模型
        4.2 質(zhì)粒的抽提和鑒定
            4.2.1 質(zhì)粒大量抽提
            4.2.2 酶切鑒定質(zhì)粒
            4.2.3 瓊脂糖凝膠電泳
        4.3 紋狀體內(nèi)質(zhì)粒注射
        4.4 側(cè)腦室內(nèi)質(zhì)粒注射
        4.5 BrdU注射
        4.6 冰凍組織切片的制備
        4.7 腦片的選取
        4.8 免疫組織化學(xué)標(biāo)記
            4.8.1 BrdU免疫組織化學(xué)標(biāo)記
            4.8.2 免疫組織化學(xué)單標(biāo)記（GFP、Pax6、RFP）
            4.8.3 免疫組織化學(xué)雙標(biāo)記
                4.8.3.1 BrdU和GFP的免疫組織化學(xué)雙標(biāo)記
                4.8.3.2 Pax6和GFP的免疫組織化學(xué)雙標(biāo)記
                4.8.3.3 DCX和vWF的免疫組織化學(xué)雙標(biāo)記
        4.9 免疫熒光標(biāo)記和激光共聚焦掃描技術(shù)
            4.9.1 免疫熒光單標(biāo)記（vWF、GFP）
            4.9.2 免疫熒光雙標(biāo)記
                4.9.2.1 GFP與nestin/Tuj-1/MAP-2/DCX/GAD67/D2L/NR1的免疫熒光雙標(biāo)記
                4.9.2.2 GFP與ChAT/CD34的免疫熒光雙標(biāo)記
                4.9.2.3 GFP與Sox2/Pax6/Oligo2的免疫熒光雙標(biāo)記
            4.9.3 免疫熒光三標(biāo)記
                4.9.3.1 NeuN、vWF與GFAP的免疫熒光三標(biāo)記
                4.9.3.2 GFP、vWF與CD133的免疫熒光三標(biāo)記
            4.9.4 激光共聚焦掃描技術(shù)
        4.10 膜片鉗技術(shù)
            4.10.1 大鼠紋狀體腦片的制備
            4.10.2 定位和細(xì)胞選取
        4.11 海馬及皮層原代神經(jīng)元培養(yǎng)
            4.11.1 胎鼠的選擇
            4.11.2 培養(yǎng)用液的選擇
            4.11.3 培養(yǎng)步驟
        4.12 免疫細(xì)胞化學(xué)及免疫熒光
        4.13 免疫印跡（Western blot）
            4.13.1 細(xì)胞總蛋白的制備
            4.13.2 Western blot
        4.14 免疫沉淀（IP）
    5. 細(xì)胞計數(shù)
    6. 數(shù)據(jù)的分析與統(tǒng)計
（三） 實驗結(jié)果
    1. 缺血腦內(nèi)神經(jīng)元新生與血管構(gòu)成之間存在密切聯(lián)系
        1.1 缺血損傷誘導(dǎo)紋狀體血管增生
        1.2 缺血損傷誘導(dǎo)紋狀體神經(jīng)元新生
        1.3 缺血損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)元新生與血管構(gòu)成之間有密切的聯(lián)系
        1.4 缺血損傷腦內(nèi)神經(jīng)血管單元的重塑
    2. 缺血腦內(nèi)內(nèi)皮來源的細(xì)胞參與神經(jīng)元新生
        2.1 pTIE2-GFP在腦內(nèi)表達(dá)相應(yīng)的蛋白
        2.2 pTIE2-GFP能示蹤內(nèi)皮來源的細(xì)胞
+細(xì)胞能轉(zhuǎn)化為神經(jīng)干細(xì)胞">        2.3 缺血腦內(nèi)GFP⁺細(xì)胞能轉(zhuǎn)化為神經(jīng)干細(xì)胞
+細(xì)胞能表達(dá)神經(jīng)發(fā)生相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子Pax6">        2.4 缺血腦內(nèi)GFP⁺細(xì)胞能表達(dá)神經(jīng)發(fā)生相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子Pax6
+細(xì)胞不參與缺血誘導(dǎo)的膠質(zhì)再生">        2.5 內(nèi)皮來源的GFP⁺細(xì)胞不參與缺血誘導(dǎo)的膠質(zhì)再生
+細(xì)胞能分化為幼稚神經(jīng)元">        2.6 缺血腦內(nèi)GFP⁺細(xì)胞能分化為幼稚神經(jīng)元
+細(xì)胞能分化為成熟神經(jīng)元">        2.7 缺血腦內(nèi)GFP⁺細(xì)胞能分化為成熟神經(jīng)元
+內(nèi)皮來源細(xì)胞具有時間依賴的神經(jīng)元新生">        2.8 缺血腦內(nèi)GFP⁺內(nèi)皮來源細(xì)胞具有時間依賴的神經(jīng)元新生
+細(xì)胞參與缺血紋狀體內(nèi)γ-氨基丁酸能和膽堿能神經(jīng)元再生">        2.9 GFP⁺細(xì)胞參與缺血紋狀體內(nèi)γ-氨基丁酸能和膽堿能神經(jīng)元再生
        2.10 缺血腦內(nèi)內(nèi)皮來源的神經(jīng)元隨時間推移逐漸發(fā)育成熟
+細(xì)胞具有神經(jīng)元的電生理活性">        2.11 缺血腦內(nèi)GFP⁺細(xì)胞具有神經(jīng)元的電生理活性
+細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化">    3. 缺血腦內(nèi)過表達(dá)VEGF促進(jìn)內(nèi)皮來源GFP⁺細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化
        3.1 phVEGF-DsRed和pDsRed在缺血腦內(nèi)表達(dá)相應(yīng)的蛋白
+細(xì)胞數(shù)量">        3.2 缺血腦內(nèi)過表達(dá)VEGF增加GFP⁺細(xì)胞數(shù)量
+細(xì)胞參與的神經(jīng)元新生">        3.3 缺血腦內(nèi)過表達(dá)VEGF促進(jìn)GFP⁺細(xì)胞參與的神經(jīng)元新生
    4. VEGF對神經(jīng)元功能的調(diào)節(jié)作用
        4.1 原代培養(yǎng)的神經(jīng)元能表達(dá)VEGF及其受體
        4.2 海馬神經(jīng)元能合成和釋放VEGF
        4.3 VEGF促進(jìn)原代培養(yǎng)的神經(jīng)元中突觸囊泡蛋白的磷酸化
        4.4 VEGF通過受體作用促進(jìn)神經(jīng)元突觸囊泡蛋白的磷酸化
（四） 討論
    1. 缺血損傷腦內(nèi)的血管重塑與神經(jīng)元新生的關(guān)系
        1.1 缺血損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)元新生
        1.2 缺血腦內(nèi)的血管重塑
        1.3 缺血腦內(nèi)的血管增生與神經(jīng)元新生之間的聯(lián)系
    2 神經(jīng)血管單元在缺血損傷修復(fù)中的意義
        2.1 神經(jīng)血管單元與缺血損傷修復(fù)的關(guān)系
        2.2 神經(jīng)血管單元重構(gòu)在缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)元新生過程中的重要性
    3. VEGF對缺血損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)血管單元重構(gòu)的作用及機制分析
        3.1 VEGF對缺血損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)元新生的影響
        3.2 VEGF促進(jìn)神經(jīng)元新生機制的探討
        3.3 VEGF對神經(jīng)血管單元重構(gòu)的作用及機制探討
（五） 小結(jié)與結(jié)論
    小結(jié)
    結(jié)論與創(chuàng)新點
（六） 圖版說明
（七） 參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
附錄
    附件一：/?77￡2-GFP質(zhì)粒大量抽提的酶切鑒定結(jié)果
    附件二 ：致謝
    附錄三：研究生期間發(fā)表及完成論文



本文編號：2958194