本文關鍵詞：耗竭NAD聯(lián)合2-DG增加腦膠質瘤U87細胞放射敏感性及其機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：本課題主要通過沉默膠質瘤細胞NAMPT基因(NAD+應急合成途徑限速酶)或者外源性加入NAD+影響細胞內NAD+含量,探討2-脫氧葡萄糖(2-DG)誘導的NAD+含量增加,在維持細胞能量代謝、氧化還原水平以及存活的關鍵作用機制,為進一步在2-DG處理下耗竭細胞內NAD+誘導細胞死亡、放射增敏提供理論依據(jù)。方法：1.在2-DG誘導的U87細胞代謝適應的研究中,Western blot法觀察不同濃度2-DG培養(yǎng)條件下,NAMPT的表達以及caspase3活化的改變,使用NAD+檢測試劑盒觀察NAD+含量變化,流式細胞儀檢測細胞內活性氧(ROS)水平；2.在NAD+介導2-DG處理下的代謝適應的研究中,小干擾RNA-NAMPT (siNAMPT)或外源性加入NAD預處理U87細胞,流式細胞儀檢測DCFH染色的細胞內ROS水平,NADPH試劑盒檢測細胞內NADPH水平；再聯(lián)合2-DG處理條件下,ATP試劑盒檢測細胞內ATP含量變化,流式細胞儀檢測Annexin-V或PI染色后U87細胞凋亡變化,Westenn blot法觀察caspase 3活化情況；3.在耗竭NAD+聯(lián)合2-DG增加膠質瘤U87細胞殺傷研究中,使用小干擾RNA-NAMPT (siNAMPT)或雜亂RNA轉染U87細胞再聯(lián)合2-DG處理,流式細胞儀檢測Annexin-V-FITC以及PI雙染的細胞陰性水平。4.在耗竭NAD+聯(lián)合2-DG增加膠質瘤U87細胞放射敏感性研究中,實驗分組為si-scramble RNA+IR、si-scramble RNA+2-DG+IR、siNAMPT+IR、siNAMPT+2-DG+IR,4Gy X射線照射,14天后,計數(shù)克隆形成水平；與克隆形成實驗分組相同,激光共聚焦顯微鏡觀察γH2AX抗體孵育的U87細胞X線照射后0,4,10,24小時DNA雙鏈斷裂數(shù)目。結果：1.單純2-DG處理條件下,Western blot結果顯示U87細胞NAMPT蛋白表達升高,NAD+檢測結果顯示U87細胞內NAD+含量增加,流式細胞儀檢測U87細胞DCFH熒光強度減弱,同時Western blot結果顯示2.5,5,10mM2-DG組相比對照組,caspase 3活化水平呈濃度依賴性下降；2.ATP試劑盒檢測結果顯示2-DG處理組比對照組ATP含量顯著下降,siNAMPT+2-DG處理組比2-DG處理組ATP含量顯著下降,2-DG+exNAD處理組比2-DG處理組ATP含量上升,證明2-DG誘導的NAD+增加參與維持細胞內的ATP含量；流式細胞儀檢測U87細胞]DCFH熒光計數(shù),結果顯示2-DG、exNAD處理組與對照組相比,細胞內ROS含量下降超過對照組的50%; FK866、siNAMPT處理組與對照組相比,細胞內ROS含量上升超過對照組的25%,證明NAD+參與細胞內ROS水平的調節(jié)；NADPH試劑盒檢測結果顯示2-DG、exNAD處理組與對照組相比,細胞內NADPH含量顯著上升；FK866、siNAMPT處理組與對照組相比,細胞內NADPH下降,證明2-DG誘導的NAD+增加通過NAD+-NADPH過程參與細胞內ROS調控。Western blot結果顯示2-DG、NAD+處理組比對照組cleaved caspase 3表達降低,siNAMPT處理組比對照組cleaved caspase 3表達增加,siNAMPT+2-DG處理組比2-DG處理組cleaved caspase 3表達增加,siNAMPT+2-DG+exNAD處理組比siNAMPT+2-DG處理組降低caspase 3活化但仍然高于2-DG處理組,證明2-DG誘導的NAD+增加參與下調細胞內凋亡過程；3.流式細胞儀檢測Annexin-V-FITC以及PI雙染的細胞陰性水平結果顯示siNAMPT+2-DG處理組對比si-scramble RNA+2-DG處理組在2-DG處理組細胞存活明顯下降,siNAMPT+2-DG+exNAD處理組比siNAMPT+2-DG處理組細胞存活上升但仍低于si-scramble RNA+2-DG處理組。4.克隆形成實驗顯示siNAMPT+2-DG處理組的細胞比si-scramble RNA、siNAMPT、si-scramble RNA+2-DG組克隆形成顯著減少,siNAMPT+2-DG處理組放射增敏比為1.64,siNAMPT、si-scramble RNA+2-DG組放射增敏比為1.30,1.23,證明耗竭NAD+顯著增加膠質瘤U87細胞放射敏感性。激光共聚焦檢測γH2AX染色的DNA雙鏈斷裂結果為siNAMPT+2-DG組比si-scramble RNA、siNAMPT、si-scramble RNA+2-DG組在4小時、10小時時間點的DNA雙鏈斷裂的數(shù)目無明顯統(tǒng)計學差異；在24小時時間點,siNAMPT+2-DG組DNA雙鏈斷裂明顯增多,超過2-DG處理組的40%,si-scramble RNA組24小時的DNA雙鏈斷裂已經基本消失,該結果提示siNAMPT+2-DG組有效影響電離輻射后DNA損傷修復進程,增加U87細胞X線照射后的DNA損傷。結論：成功驗證了NAD+-增加有利于維持U87細胞ATP穩(wěn)態(tài),降低細胞內ROS以及抑制caspase 3的活化；進一步研究表明抑制NAD+聯(lián)合2-DG能夠有效殺傷膠質瘤U87細胞,提高U87細胞的放射敏感性,該研究結果未見相關文獻報道。
【關鍵詞】：2-DG NAD~+ 代謝適應 腦膠質瘤細胞 細胞殺傷 放射增敏
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R739.41;R730.55
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 引言9-12
• 第一部分：NAD~+對2-DG誘導代謝適應的影響12-38
• 一、2-DG對膠質瘤U87細胞的能量代謝、氧化還原平衡以及凋亡的影響12-21
• 二、2-DG對膠質瘤U87細胞的NAD~+含量以及NAMPT基因表達影響21-25
• 三、2-DG處理下的NAD~+增加對膠質瘤U87細胞能量代謝、氧化還原平衡以及凋亡的影響25-38
• 第二部分：耗竭NAD~+對2-DG處理下的細胞存活以及放射敏感性的影響38-51
• 一、耗竭NAD~+對2-DG處理下的膠質瘤U87細胞存活的影響38-43
• 二、耗竭NAD~+對2-DG處理下的膠質瘤U87細胞放射敏感性的影響43-51
• 參考文獻51-57
• 綜述57-67
• 參考文獻62-67
• 英文縮略詞表67-68
• 攻讀學位期間本人公開發(fā)表的論文及獲得專利68-70
• 致謝70-72

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本文編號：290730