發(fā)布時間：2020-12-07 22:45

　　目的:膠質(zhì)母細胞瘤是顱內(nèi)惡性度最高的原發(fā)性腫瘤。膠質(zhì)母細胞瘤的臨床治療手段主要包括手術切除以及術后的放療、化療。然而,膠質(zhì)母細胞瘤患者的中位生存期并未隨著醫(yī)療技術的改善而相應的延長。血管新生促進膠質(zhì)母細胞瘤的演進,因此靶向膠質(zhì)母細胞瘤血管新生的治療方案有潛在的應用前景。然而血腫瘤屏障的存在,極大地限制了大分子化療藥物進入腫瘤組織,降低了療效。因此增加血腫瘤屏障通透性并抑制膠質(zhì)瘤血管新生可能成為一種更有效的膠質(zhì)瘤治療手段。膠質(zhì)母細胞瘤內(nèi)皮細胞的增殖、遷移及管腔形成是內(nèi)皮細胞依賴性血管新生的重要過程。同時,膠質(zhì)母細胞瘤內(nèi)皮細胞是血腫瘤屏障的重要結(jié)構(gòu)基礎。因此靶向調(diào)節(jié)膠質(zhì)母細胞瘤內(nèi)皮細胞的生物學行為可能調(diào)控膠質(zhì)母細胞瘤的血管新生及血腫瘤屏障的通透性。敲減長鏈非編碼RNA XIST,抑制膠質(zhì)瘤干細胞的增殖、遷移、侵襲并促進其凋亡。而XIST是否調(diào)控膠質(zhì)母細胞瘤內(nèi)皮細胞的增殖、遷移、管腔形成及血腫瘤屏障通透性未見文獻報道。RNA結(jié)合蛋白G3BP2可調(diào)控肝細胞癌和乳腺癌的生物學行為。而G3BP2在膠質(zhì)母細胞瘤內(nèi)皮細胞中的調(diào)控作用未見文獻報道。膠質(zhì)母細胞瘤細胞分泌大量促血管生成因子,從而營造了強烈的... 

【文章來源】：中國醫(yī)科大學遼寧省

【文章頁數(shù)】：117 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略語
第一部分 長鏈非編碼RNAXIST通過靶向miR-137調(diào)節(jié)血腫瘤屏障通透性和膠質(zhì)瘤母細胞瘤血管新生的機制研究
    1 前言
    2 材料和方法
        2.1 實驗材料
            2.1.1 實驗細胞株
            2.1.2 主要試劑
            2.1.3 主要實驗儀器
        2.2 實驗方法
            2.2.1 細胞培養(yǎng)
            2.2.2 細胞凍存
            2.2.3 細胞復蘇
            2.2.4 細胞計數(shù)
            2.2.5 體外血腫瘤屏障模型的建立
            2.2.6 Trizol法提取RNA
            2.2.7 Real-timePCR方法分別檢測XIST、miR-137及FOXC1mRNA的表達變化
            2.2.8 細胞轉(zhuǎn)染
            2.2.9 雙熒光素酶報告基因檢測
            2.2.10 跨內(nèi)皮阻抗值（TEER）的測量
            2.2.11 辣根過氧化物酶（HRP）滲出量的測定
            2.2.12 內(nèi)皮細胞生長抑制實驗（CCK-8法）
            2.2.13 內(nèi)皮細胞遷移實驗
            2.2.14 內(nèi)皮細胞管腔形成實驗
            2.2.15 Westernblot
            2.2.16 免疫熒光
            2.2.17 RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀（RIP）
            2.2.18 染色質(zhì)免疫共沉淀（CHIP）實驗
        2.3 統(tǒng)計方法
    3 實驗結(jié)果
        3.1 XIST在GECs中高表達,在GECs中敲減XIST的表達增加BTB通透性并抑制膠質(zhì)母細胞瘤血管新生
        3.2 XIST結(jié)合miR-137,XIST與miR-137相互負性抑制
        3.3 miR-137參與XIST對BTB通透性和膠質(zhì)母細胞瘤血管新生的調(diào)控
        3.4 miR-137在GECs中低表達,過表達miR-137增加BTB通透性,抑制膠質(zhì)母細胞瘤血管新生
        3.5 miR-137靶向調(diào)節(jié)ZO-2和FOXC1的表達
        3.6 FOXC1在GECs中高表達,敲減FOXC1的表達增加BTB通透性并抑制膠質(zhì)母細胞瘤血管新生
        3.7 過表達FOXC1通過結(jié)合ZO-1、occludin和CXCR7的啟動子區(qū)促進上述蛋白的表達
        3.8 FOXC1參與miR-137對BTB通透性和膠質(zhì)瘤血管新生的調(diào)控。
    4 討論
    5 結(jié)論
第二部分 ：RNA結(jié)合蛋白G3BP2通過增加HEIH的穩(wěn)定性促進膠質(zhì)母細胞瘤內(nèi)皮細胞血管新生機制研究
    1 前言
    2 材料和方法
        2.1 實驗材料
            2.1.1 實驗材料
            2.1.2 主要試劑
            2.1.3 主要實驗儀器
        2.2 實驗方法
            2.2.1 細胞培養(yǎng)、凍存、復蘇
            2.2.2 實時定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）
            2.2.3 構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染穩(wěn)轉(zhuǎn)G3BP2、HEIH、IRF6、CYR61過表達及表達沉默的細胞系及分組
            2.2.4 膠質(zhì)母細胞瘤條件培養(yǎng)基的制備
            2.2.5 內(nèi)皮細胞生長抑制實驗（CCK-8法）、內(nèi)皮細胞遷移實驗及內(nèi)皮細胞管腔形成實驗
            2.2.6 Westernblot
            2.2.7 染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）
            2.2.8 基質(zhì)膠栓體內(nèi)血管生成實驗
        2.3 統(tǒng)計方法
    3 實驗結(jié)果
        3.1 G3BP2在GECs中高表達,敲減G3BP2抑制GECs的細胞活力、遷移及管腔形成
        3.2 敲減G3BP2下調(diào)GECs中HEIH的表達水平,并降低HEIH的穩(wěn)定性
        3.3 HEIH在GECs中高表達,過表達HEIH促進GECs的細胞活力、遷移及管腔形成
        3.4 HEIH參與了G3BP2對GECs細胞活力、遷移及管腔形成等生物學行為的調(diào)控
        3.5 HEIH以SMD的方式下調(diào)IRF6的表達
        3.6 IRF6在GECs低表達,過表達IRF6抑制GECs的細胞活力、遷移及管腔形成能力
        3.7 HEIH通過靶向IRF6的3'-UTR區(qū)促進GECs血管新生
        3.8 IRF6在轉(zhuǎn)錄水平抑制CYR61的表達
        3.9 CYR61在GECs高表達,敲減CYR61抑制GECs血管新生
        3.10 聯(lián)合敲減G3BP2及HEIH的表達抑制體內(nèi)GECs血管新生
    4 討論
    5 結(jié)論
第三部分 ：轉(zhuǎn)錄因子NFAT5調(diào)節(jié)SBF2-AS1/miR-338-3p介導的EGFL7的表達改變促進膠質(zhì)母細胞瘤誘導的血管新生機制研究
    1 前言
    2 材料和方法
        2.1 實驗材料
            2.1.1 實驗材料
            2.1.2 主要試劑
            2.1.3 主要實驗儀器
        2.2 實驗方法
            2.2.1 細胞培養(yǎng)、凍存、復蘇
            2.2.2 實時定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）
            2.2.3 構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染穩(wěn)轉(zhuǎn)NFAT5、SBF2-AS1表達沉默的細胞系及分組
            2.2.4 瞬轉(zhuǎn)miR-338-3p過表達與沉默及分組
            2.2.5 SBF2-AS1與miR-338-3p共轉(zhuǎn)染
            2.2.6 穩(wěn)轉(zhuǎn)EGFL7過表達細胞系,隨后與miR-338-3p雙重轉(zhuǎn)染
            2.2.7 膠質(zhì)瘤條件培養(yǎng)基的制備
            2.2.8 內(nèi)皮細胞生長抑制實驗（CCK-8法）、內(nèi)皮細胞遷移實驗及內(nèi)皮細胞管腔形成實驗
            2.2.9 Westernblot
            2.2.10 雙熒光素酶報告基因表達分析
            2.2.11 染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）
            2.2.12 裸鼠皮下移植瘤實驗
        2.3 統(tǒng)計學方法
    3 實驗結(jié)果
        3.1 NFAT5的表達水平與膠質(zhì)瘤的WHO臨床分級正相關
        3.2 敲減U87及U118細胞中的NFAT5的表達,抑制膠質(zhì)母細胞瘤細胞誘導的血管新生
        3.3 SBF2-AS1在膠質(zhì)瘤中高表達,敲減U87及U118細胞中的SBF2-AS1的表達,抑制膠質(zhì)母細胞瘤細胞誘導的體外血管新生
        3.4 NFAT5在轉(zhuǎn)錄水平促進SBF2-AS1的表達
        3.5 SBF2-AS1參與了NFAT5對膠質(zhì)母細胞瘤細胞誘導的血管新生的調(diào)控
        3.6 SBF2-AS1吸附miR-338-3p,而miR-338-3p參與了SBF2-AS1對膠質(zhì)母細胞瘤細胞誘導的血管新生的調(diào)控
        3.7 上調(diào)miR-338-3p通過靶向EGFL7的3’UTR區(qū)抑制EGFL7的表達及分泌
        3.8 上調(diào)miR-338-3p通過靶向EGFL7的3’-UTR區(qū)抑制EGFL7誘導的膠質(zhì)母細胞瘤血管新生
        3.9 敲減NFAT5及SBF2-AS1的表達抑制U87及U118細胞中EGFL7的表達及分泌,但不影響EGFL7的mRNA水平
        3.10 聯(lián)合敲減NFAT5及SBF2-AS1抑制膠質(zhì)母細胞瘤移植瘤生長的效果最顯著
    4 討論
    5 結(jié)論
本研究創(chuàng)新性的自我評價
參考文獻
綜述
    參考文獻
攻讀學位期間取得的研究成果
致謝
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本文編號：2904013