糖尿病是一種常見的以高血糖為主要特征的代謝紊亂疾病,主要以2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)為主。近年來,T2DM的患病率正在不斷提高。T2DM會造成全身多器官損傷的并發(fā)癥,已成為致殘和致死的主要原因,其中T2DM引起的腦損傷越來越受到關(guān)注。但是,T2DM引起的腦損傷的機(jī)制仍不清楚。因此,對T2DM引起的腦損傷的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行深入的探討,將有助于尋找合適的治療策略或新藥研發(fā)。自噬是細(xì)胞內(nèi)的基本生物學(xué)過程,對維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài),保持機(jī)體健康起著重要作用。自噬不僅能抑制炎癥因子的產(chǎn)生,降低氧自由基,抑制細(xì)胞凋亡,并能為細(xì)胞器的更新提供原料。因此,自噬調(diào)節(jié)可能是一個(gè)安全有效的策略以防治T2DM引起的腦損傷。COX2已經(jīng)被證明參與多種急慢性神經(jīng)損傷,COX2抑制劑可能是改善糖尿病認(rèn)知功能障礙的有效藥物。考慮到糖尿病是一種慢性疾病,糖尿病腦損傷的防治需要長時(shí)間給藥,長時(shí)間使用COX2抑制劑會導(dǎo)致心臟、腎臟等嚴(yán)重副作用,因此COX2下游的前列腺素及其受體可能是糖尿病腦損傷防治更合適的靶點(diǎn)。PGD2是腦中含量最多的前列腺素,其通過受體DP1和DP2發(fā)揮作用。DP1和DP2在不同病因?qū)е碌膿p傷中作用具有爭議。而DP1和DP2在糖尿病腦損傷中的作用仍不清楚。已有研究發(fā)現(xiàn)在抑制腦組織COX2能明顯抑制自噬。這些結(jié)果提示糖尿病腦損傷的病生過程存在PGD2-DPs途徑和自噬水平改變。本研究擬觀察T2DM腦損傷大鼠腦組織PGD2-DPs途徑和自噬水平的變化,并初步闡明糖尿病腦損傷機(jī)制可能涉及PGD2-DPs途徑對自噬的調(diào)控。第一部分糖尿病腦損傷大鼠腦PGD2-DPs途徑及自噬水平變化目的:觀察糖尿病腦損傷大鼠皮層和海馬PGD2-DPs途徑及自噬水平變化;給予COX2抑制劑降低PGD2水平,觀察其對糖尿病大鼠腦損傷的影響,擬初步觀察PGD2-DPs途徑及自噬水平變化與糖尿病腦損傷機(jī)制是否存在相關(guān)性。方法:1.從60只雄性SD大鼠(體質(zhì)量為80-100g)中隨機(jī)挑選10只作為正常對照組。剩余50只作為模型組,給予高脂高糖飲食喂養(yǎng)一個(gè)月后,腹腔注射STZ(40mg/kg)一次。造模完成后,將造模成功的大鼠隨機(jī)分為3組:模型組,模型+COX2抑制劑低劑量組(Meloxicam,1mg·kg~(-1)),模型組+COX2抑制劑高劑量組(Meloxicam,3mg·kg~(-1))每組各10只。正常組和模型組灌胃給予0.5%CMC-Na,模型+COX2抑制劑組灌胃給與美洛昔康,繼續(xù)正常飲食喂養(yǎng)八周。2.血糖儀檢測大鼠空腹血糖;Morris水迷宮檢測大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力;HE染色觀察大鼠皮層和海馬神經(jīng)元;生化試劑盒檢測大鼠血漿TG、TC和LDL的水平;ELISA試劑盒檢測大鼠皮層和海馬PGD2含量和大鼠血漿中胰島素的含量;Western blotting測定大鼠皮層和海馬COX2、DP1、DP2、P62和LC3BII蛋白的表達(dá)。結(jié)果:1.在停止給藥時(shí),模型組與COX2抑制劑組每組均剩9只大鼠。與正常對照組相比,模型組大鼠空腹血糖水平明顯升高(P0.01),血漿胰島素含量明顯降低(P0.01);模型組大鼠血漿TC和TG水平明顯升高(P0.01),而血漿LDL水平?jīng)]有明顯變化;模型組大鼠水迷宮行為學(xué)檢測發(fā)現(xiàn),尋臺潛伏期時(shí)間明顯延長(P0.01),平臺穿梭次數(shù)明顯減少(P0.01);糖尿病大鼠皮層和海馬出現(xiàn)明顯的神經(jīng)元核固縮和核深染;模型組大鼠皮層和海馬PGD2水平明顯上升(P0.01);模型組大鼠海馬及皮層COX2(P0.01)、DP2(P0.05)和p62(P0.01)蛋白表達(dá)明顯升高,DP1(P0.01)和LC3BII(P0.01)的蛋白表達(dá)明顯降低。2.與模型組相比,COX2抑制劑處理組大鼠血糖、血漿胰島素、TG、TC和LDL水平?jīng)]有明顯變化;大鼠尋臺潛伏期時(shí)間明顯縮短(P0.01),平臺穿梭次數(shù)明顯增加(P0.01);大鼠皮層和海馬的神經(jīng)元核固縮和核深染得到明顯改善;海馬及皮層的PGD2含量明顯降低(P0.01);大鼠海馬及皮層中COX2(P0.01)和p62(P0.01)蛋白表達(dá)明顯降低,而LC3BII的蛋白表達(dá)明顯上升(P0.01)。結(jié)論:結(jié)果初步提示糖尿病腦損傷大鼠皮層和海馬PGD2-DPs途徑異常及自噬水平明顯降低;抑制COX2降低PGD2含量,進(jìn)而促進(jìn)自噬可能對糖尿病大鼠腦損傷有保護(hù)作用。第二部分高糖處理HT22細(xì)胞PGD2-DPs途徑及自噬水平變化目的:觀察高糖處理HT22細(xì)胞PGD2-DPs途徑及自噬水平變化;給予COX2抑制劑降低PGD2水平,在體外細(xì)胞水平初步觀察PGD2-DPs途徑及自噬水平變化與高糖致HT22細(xì)胞損傷機(jī)制的相關(guān)性。方法:1.高糖損傷HT22細(xì)胞模型建立及分組:高糖培養(yǎng)基(75mM)作用于HT22細(xì)胞36h,建立高糖致HT22細(xì)胞損傷模型。分為正常對照組、高糖處理組(HG)。HG+COX2抑制劑(meloxicam)組,HG+自噬抑制劑(wortmannin)和HG+自噬激動劑(rapamycin)組。2.主要觀察指標(biāo):采用光鏡觀察各組HT22細(xì)胞數(shù)目和形態(tài);ELISA測定細(xì)胞PGD2含量;透射電鏡檢測細(xì)胞自噬溶酶體數(shù)量;MTT法測定細(xì)胞的存活率;LDH測定細(xì)胞死亡率;流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡和壞死率。Western blotting測定細(xì)胞DP1、DP2、P62和LC3BII蛋白的表達(dá)。結(jié)果:1.與正常組相比,HG組HT22細(xì)胞的MTT值和細(xì)胞數(shù)目明顯降低;LDH漏出率、凋亡和壞死率明顯上升;自噬溶酶體數(shù)量明顯上升;PGD2含量明顯升高(P0.01);COX2(P0.01)、DP1(P0.01)、DP2(P0.05)和P62(P0.05)蛋白表達(dá)明顯升高,而LC3BII(P0.01)蛋白表達(dá)明顯降低。2.與HG組相比,自噬抑制劑能明顯降低HG組HT22細(xì)胞的MTT值,而自噬激動劑能明顯升高HG組HT22細(xì)胞的MTT值;COX2抑制劑能明顯增加HG組HT22細(xì)胞的MTT值和細(xì)胞數(shù)目,降低LDH漏出率及凋亡和壞死率;COX2抑制劑能明顯降低HG組HT22細(xì)胞的PGD2含量(P0.01);COX2抑制劑能明顯降低HG組HT22細(xì)胞COX2(P0.05)和p62(P0.05)蛋白表達(dá),而明顯升高LC3BII(P0.01)蛋白表達(dá)。結(jié)論:結(jié)果初步提示高糖處理HT22細(xì)胞PGD2-DPs途徑異常及自噬水平明顯降低;COX2抑制劑對高糖致HT22細(xì)胞有保護(hù)作用,其可能涉及降低PGD2含量,進(jìn)而升高自噬水平。第三部分PGD2-DP2調(diào)控自噬對高糖致HT22細(xì)胞損傷的作用觀察目的:觀察DP2干預(yù)對高糖致HT22細(xì)胞損傷的影響,并初步明確其機(jī)制是否通過PI3K/AKT/mTOR通路進(jìn)而影響自噬調(diào)控。方法:1.實(shí)驗(yàn)分組:高糖培養(yǎng)基(75mM)作用于HT22細(xì)胞36h,并分別給與DP2激動劑和抑制劑,以及DP2激動劑和抑制劑分別聯(lián)合給予自噬促進(jìn)劑和自噬抑制劑。實(shí)驗(yàn)分組為:正常組、HG組、HG+DP2激動劑組、HG+DP2激動劑+rapamycin組、HG+DP2抑制劑組和HG+DP2抑制劑+wortmannin組2.主要觀察指標(biāo):采用光鏡觀察各組HT22細(xì)胞數(shù)目和形態(tài);MTT檢測細(xì)胞存活率;LDH檢測細(xì)胞死亡率;流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡和壞死率;Western blotting測定細(xì)胞中PI3K、AKT、p-AKT(s473)、mTOR、p-mTOR(s2448)、p62和LC3BII蛋白的表達(dá)。結(jié)果:1.相比于HG組,HG+DP2激動劑組HT22細(xì)胞的MTT值明顯降低(P0.05),而LDH漏出率明顯升高(P0.01);HG+DP2抑制劑組HT22細(xì)胞的MTT值明顯升高(P0.05),而LDH漏出率明顯降低(P0.05)。相比于HG+DP2激動劑組,HG+DP2激動劑+rapamycin組HT22細(xì)胞的MTT值明顯升高(P0.05),LDH漏出率明顯降低(P0.01)。相比于HG+DP2抑制劑組,HG+DP2抑制劑+wortmannin組HT22細(xì)胞的MTT值明顯降低(P0.05),LDH漏出率明顯升高(P0.01)。2.光鏡下可見,與正常組相比,HG組HT22細(xì)胞數(shù)目明顯降低。與HG組相比,HG+DP2激動劑組HT22細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目明顯降低,而HG+DP2抑制劑組HT22細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目明顯升高。與HG+DP2激動劑組相比,HG+DP2激動劑+rapamycin組HT22細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目明顯升高,與HG+DP2抑制劑組相比,HG+DP2抑制劑+wortmannin組HT22細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目明顯降低。3.流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn),與正常組相比,HG組HT22細(xì)胞的壞死和凋亡率明顯增加;DP2激動劑能明顯進(jìn)一步升高HG處理HT22的細(xì)胞的壞死和凋亡率,而合用rapamycin能明顯阻遏DP2激動劑的效應(yīng);DP2抑制劑能明顯降低HG處理的HT22細(xì)胞壞死和凋亡率,而合用wortmannin能明顯阻遏DP2抑制劑的效應(yīng)。4.與正常組相比,HG組HT22細(xì)胞中PI3K(P0.05)、AKT(P0.01)、p-AKT(s473)(P0.01)、mTOR(P0.05)、p-mTOR(s2448)(P0.05)和p62(P0.01)的蛋白表達(dá)明顯升高,而LC3BII(P0.05)的蛋白表達(dá)明顯降低。與HG組相比,HG+DP2激動劑組HT22細(xì)胞中PI3K(P0.05)、AKT(P0.05)、p-AKT(s473)(P0.05)、mTOR(P0.05)、p-mTOR(s2448)(P0.05)和p62(P0.01)蛋白表達(dá)明顯升高,而LC3BII(P0.05)蛋白表達(dá)明顯降低;HG+DP2抑制劑組HT22細(xì)胞中PI3K(P0.05)、AKT(P0.05)、p-AKT(s473)(P0.05)、mTOR(P0.05)、p-mTOR(s2448)(P0.05)和p62(P0.05)蛋白表達(dá)的明顯降低,而LC3BII(P0.05)蛋白表達(dá)明顯升高。與HG+DP2激動劑組相比,HG+DP2激動劑+rapamycin組HT22細(xì)胞中mTOR(P0.05)、p-mTOR(s2448)(P0.01)和p62(P0.01)的蛋白表達(dá)明顯降低,而LC3BII(P0.05)蛋白表達(dá)明顯升高,PI3K、AKT和p-AKT(s473)蛋白表達(dá)沒有明顯影響。相比于HG+DP2抑制劑組,HG+DP2激動劑+wortmannin組HT22細(xì)胞中p62(P0.01)蛋白表達(dá)明顯升高,LC3BII(P0.05)蛋白表達(dá)明顯降低,而PI3K、AKT、p-AKT(s473)、mTOR和p-mTOR(s2448)蛋白表達(dá)沒有明顯影響。結(jié)論:DP2受體激動能激活PI3K/AKT/mTOR通路,進(jìn)而抑制自噬,促進(jìn)了高糖致HT22細(xì)胞損傷。第四部分PGD2-DP1調(diào)控自噬對高糖致HT22細(xì)胞損傷的作用觀察目的:觀察DP1干預(yù)對高糖致HT22細(xì)胞損傷的影響,并初步明確其機(jī)制是通否過PKA/mTOR通路進(jìn)而調(diào)控自噬。方法:1.DP1干預(yù)對高糖致HT22細(xì)胞損傷、自噬水平和cAMP/PKA-C/mTOR通路的影響觀察。(1)高糖培養(yǎng)基(75mM)作用于HT22細(xì)胞36h,高糖刺激的同時(shí)分別給與DP1的激動劑和抑制劑,給與DP1抑制劑的同時(shí)給與rapamycin。實(shí)驗(yàn)分組:正常組、HG組、HG+DP1激動劑組、HG+DP1抑制劑組和HG+DP1抑制劑+rapamycin組(僅用于MTT,LDH和流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn))。(2)主要觀察指標(biāo):MTT檢測細(xì)胞存活率,LDH漏出率測定細(xì)胞死亡率;采用光鏡觀察細(xì)胞數(shù)目和形態(tài)變化;流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡和壞死率;ELISA測定細(xì)胞cAMP含量;Western blotting測定細(xì)胞PKA-C(α/β)、mTOR、p-mTOR(s2448)、p62和LC3BII蛋白表達(dá)。2.DP1是否通過PKA-C調(diào)控mTOR表達(dá)觀察(1)DP1通過PKA-C影響mTOR表達(dá)觀察:實(shí)驗(yàn)分組:正常組、正常+空載病毒組、HG組、HG+空載病毒組、HG+PKA-C(α/β)shRNA(α和β分別沉默)組、HG+DP1激動劑、HG+PKA-C(α/β)shRNA(α和β分別沉默)+DP1激動劑組。采用Western blotting觀察HT22細(xì)胞PKA-C(α/β)、mTOR和p-mTOR(s2448)蛋白表達(dá)。(2)PKA-C與mTOR相互作用觀察:采用免疫共沉淀技術(shù)檢測PKA-C(α/β)和mTOR是否具有直接結(jié)合。結(jié)果:1.DP1干預(yù)對高糖致HT22細(xì)胞損傷的自噬水平和cAMP/PKA-C/mTOR通路的影響。(1)與HG組相比,HG+DP1激動劑組HT22細(xì)胞的MTT值明顯升高(P0.05),而LDH漏出率明顯降低(P0.05);HG+DP1抑制劑組HT22的MTT值明顯降低(P0.05),而LDH的漏出率明顯升高(P0.05)。與HG+DP1抑制劑組相比,HG+DP1抑制劑合用rapamycin后能明顯阻遏DP1抑制劑對HG處理HT22細(xì)胞MTT值和LDH的漏出率的影響。(2)光鏡下可見,與HG組相比,HG+DP1激動劑組HT22細(xì)胞數(shù)目明顯增加;HG+DP1抑制劑組HT22細(xì)胞數(shù)目明顯降低。與HG+DP1抑制劑組相比,HG+DP1抑制劑合用rapamycin能明顯升高HT22細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目。(3)與正常組相比,HG組HT22細(xì)胞cAMP含量明顯升高(P0.05)。與HG組相比,HG+DP1激動劑組cAMP含量明顯增加(P0.05),而HG+DP1抑制劑組cAMP含量明顯降低(P0.01)。流式細(xì)胞術(shù)檢測也發(fā)現(xiàn),DP1激動劑能明顯降低HG處理HT22細(xì)胞的壞死和凋亡率;DP1抑制劑能明顯升高HG處理HT22細(xì)胞的壞死和凋亡率,而合用rapamycin能明顯阻遏DP1抑制劑的效應(yīng)。(4)與正常組相比,HG組HT22細(xì)胞中PKA-C(α/β)(P0.05)、mTOR(P0.05),p-mTOR(s2448)(P0.05)和p62(P0.01)蛋白表達(dá)明顯上升,而LC3BII(P0.01)蛋白表達(dá)明顯降低。與HG組相比,HG+DP1激動劑組HT22細(xì)胞中PKA-C(α/β)(P0.05)和LC3BII(P0.05)蛋白表達(dá)明顯上調(diào),而mTOR(P0.05)、p-mTOR(s2448)(P0.05)和p62(P0.05)蛋白表達(dá)明顯降低;HG+DP1抑制劑組HT22細(xì)胞中PKA-C(α/β)(P0.05)和LC3BII(P0.05)蛋白表達(dá)明顯降低,而mTOR(P0.05),p-mTOR(s2448)(P0.05)和p62(P0.05)蛋白表達(dá)明顯升高。2.DP1通過PKA-C影響mTOR表達(dá)(1)與正常組相比,HG組中HT22細(xì)胞中PKA-C(α/β)(P0.01)、mTOR(P0.01)和p-mTOR(s2448)(P0.01)蛋白表達(dá)明顯升高。與HG組相比,HG+PKA-C(α)shRNA組HT22細(xì)胞中PKA-C(α/β)(P0.01)蛋白表達(dá)明顯降低,而mTOR(P0.01)和p-mTOR(s2448)(P0.01)蛋白表達(dá)明顯上升;PKA-C(β)shRNA組HT22細(xì)胞中PKA-C(α/β)(P0.01)蛋白表達(dá)明顯降低,mTOR(P0.01)和p-mTOR(s2448)(P0.01)蛋白表達(dá)明顯上升。(2)與HG組相比,HG+DP1激動劑組HT22細(xì)胞中PKA-C(α/β)(P0.05)蛋白表達(dá)明顯升高,mTOR(P0.05)和p-mTOR(s2448)(P0.05)蛋白表達(dá)明顯降低。與HG+DP1激動劑組相比,HG+PKA-C(α)shRNA+DP1激動劑組HT22細(xì)胞中PKA-C(α/β)(P0.05)蛋白表達(dá)明顯降低,mTOR(P0.05)和p-mTOR(s2448)(P0.05)蛋白表達(dá)明顯上升;HG+PKA-C(β)shRNA+DP1激動劑組HT22細(xì)胞中PKA-C(α/β)(P0.05)的蛋白表達(dá)明顯降低,mTOR(P0.05)和p-mTOR(s2448)(P0.05)蛋白表達(dá)明顯升高。(3)Co-IP實(shí)驗(yàn)證明PKA的催化亞基與mTOR有直接結(jié)合。結(jié)論:(1)mTOR可能是DP1下游通路蛋白;PKA的催化亞基與mTOR有直接結(jié)合。(2)PKA的催化亞基α和β都參與了mTOR表達(dá)的抑制。(3)DP1受體通過激活PKA/mTOR通路促進(jìn)自噬改善高糖致HT22細(xì)胞損傷。
【學(xué)位單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R587.2;R747.9
【部分圖文】：

重慶醫(yī)科大學(xué)博士研究生學(xué)位論文2 結(jié)果2.1 糖尿病大鼠體質(zhì)量、血糖和血漿胰島素的變化與正常組相比，模型組和給藥組大鼠血糖含量明顯升高(P<0.01)，胰島素含量和體質(zhì)量明顯降低(P<0.01)。以上結(jié)果說明模型組和給藥組大鼠基本符合 T2DM 特征。COX2 抑制劑組大鼠血糖、胰島素和體質(zhì)量均沒有明顯變化(圖 1)。

圖 1 糖尿病大鼠血糖、血漿胰島素和體質(zhì)量的變化(x± s ,n=9)1The levels of blood glucose, plasma insulin and body weight of the diabetic rats(x± s ,n=9).**P<0.01 compared with normal group.2 糖尿病大鼠血漿 TG、TC 和 LDL 水平變化與正常組相比，模型組和給藥組大鼠血漿中 TG(P<0.01)和 TC(P<0.01)的含量顯上升，而 LDL 沒有沒有明顯變化。以上結(jié)果說明模型組和給藥組大鼠基本符合 T2DM 特征。COX2 抑制劑組大鼠血漿 TG、TC 和 LDL 沒有明顯改變(圖 2)

重慶醫(yī)科大學(xué)博士研究生學(xué)位論文2.3 糖尿病大鼠學(xué)習(xí)記憶能力改變與正常組相比，模型組大鼠尋臺潛伏期在第 4 天開始出現(xiàn)明顯延長 (P<0.05)；且第 5 天的穿越平臺次數(shù)也明顯減少(P<0.01)，說明大鼠的學(xué)習(xí)和記憶功能有降低。與模型組相比，COX2 抑制劑組大鼠的尋臺潛伏期明顯縮短(P<0.01)，且第 5天的穿越平臺次數(shù)也明顯增加(P<0.01)，說明大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能得到明顯改善(圖 3-1)。從尋臺的軌跡圖上我們也可以看出，正常組大鼠的尋臺的活動區(qū)域集中在平臺位置附近，模型組大鼠尋臺的活動區(qū)域明顯偏離平臺位置，在給與 COX2抑制劑后大鼠尋臺活動區(qū)域逐漸向平臺附近區(qū)域靠近(圖 3-2)。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 畢艷;;中國糖尿病慢性并發(fā)癥的流行病學(xué)研究現(xiàn)況[J];中華糖尿病雜志;2015年08期

2 劉子琪;劉愛萍;王培玉;;中國糖尿病患病率的流行病學(xué)調(diào)查研究狀況[J];中華老年多器官疾病雜志;2015年07期

3 江基堯;;提高中國顱腦創(chuàng)傷臨床救治成功率之我見[J];中華神經(jīng)外科雜志;2014年08期

本文編號：2825642