本文關鍵詞：人類神經(jīng)管畸形患者攜帶STIL基因稀有變異E863K和A1047D干擾SHH信號轉(zhuǎn)導進而抑制細胞增殖，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:在神經(jīng)管發(fā)育過程中,STIL基因參與SHH信號通路傳導,通過影響神經(jīng)祖細胞的增殖,促進神經(jīng)管的正常發(fā)育。STIL基因敲除的小鼠胚胎出現(xiàn)神經(jīng)管閉合失敗,前腦無裂畸形、中線和左右軸不對稱畸形。我們在部分人類NTD樣本觀察到STIL基因稀有突變的現(xiàn)象,本研究的目的是探索STIL基因稀有突變是否會影響神經(jīng)管發(fā)育過程中SHH通路的信號傳導,以及STIL基因稀有突變與人類NTD是否具有相關性。方法:采用人類NTD樣本與正常樣本,通過高通量測序檢測神經(jīng)管畸形患者是否富集STIL基因稀有變異,采用SPSS16.0與European Molecular Biology Laboratory(EMB I)和National Center for Biotechnology Information(NCBI)對稀有變異進行生物信息學分析,對稀有突變位點進行篩選和驗證。對篩選出可能具有功能破壞性的稀有變異位點構建突變體質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染HEK293T細胞,利用細胞免疫熒光技術確定重組質(zhì)粒的正確定位。利用western blot技術檢測STIL蛋白表達水平,通過免疫共沉淀方法檢測STIL與SUFU相互作用,利用real time PCR技術檢測STIL及靶基因Gli1轉(zhuǎn)錄因子m RNA表達水平;通過CCK8細胞增殖檢測方法,在轉(zhuǎn)染后檢測突變體對細胞增殖的影響。結(jié)果:1、通過對全基因組測序新發(fā)突變結(jié)果進行分析,我們所測NTD樣本中12.15%存在STIL基因稀有變異,其中,2.54%攜帶稀有錯義突變。2、運用western blot技術和real time PCR技術檢測稀有變異影響基因表達,其中,STIL基因E863K、A1047D蛋白質(zhì)水平下降和E863K m RNA水平表達下降。3、通過對SHH信號通路靶基因Gli1的m RNA水平檢測,推測STIL基因E863K變異削弱了STIL對SHH通路的正向調(diào)控。4、采用CCK8方法,檢測細胞增殖,發(fā)現(xiàn)STIL基因E863K、A1047D變異影響了HEK293T細胞的增殖能力。結(jié)論:STIL基因稀有變異影響基因表達,從而影響蛋白質(zhì)功能變化,可能會引起SHH通路信號轉(zhuǎn)導功能紊亂,影響SHH信號通路下游靶基因的轉(zhuǎn)錄功能,靶基因轉(zhuǎn)錄水平降低,引起神經(jīng)管形成過程中神經(jīng)細胞的增殖減少,最終導致了NTD的發(fā)生。這個發(fā)現(xiàn)揭示了STIL基因具有功能破壞性的稀有變異可能會通過SHH信號通路途徑,損害胚胎神經(jīng)管正常發(fā)育,是導致神經(jīng)管畸形發(fā)生的一種可能性因素。
【關鍵詞】：STIL基因 NTDs SHH信號通路 正向調(diào)控 細胞增殖
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R741
【目錄】：

• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-10
• 常用縮寫詞中英文對照表10-11
• 前言11-13
• 第一部分 人類神經(jīng)管畸形病例攜帶STIL基因稀有變異13-23
• 1 材料與方法13-18
• 1.1 人類組織樣本13-14
• 1.2 質(zhì)粒相關試劑14
• 1.3 主要試劑配制14
• 1.4 主要儀器14-15
• 1.5 方法15-18
• 2 結(jié)果18-23
• 2.1 神經(jīng)管畸形胎兒存在STIL基因稀有變異18-19
• 2.2 STIL基因錯義突變的分布特征19-21
• 2.3 重組質(zhì)粒DNA的鑒定21-23
• 第二部分 STIL通過參與SHH信號通路調(diào)節(jié)細胞增殖23-39
• 1 材料與方法23-35
• 1.1 細胞和抗體23
• 1.2 主要試劑23-25
• 1.3 主要試劑配制25-27
• 1.4 主要儀器27-28
• 1.5 方法28-35
• 2 結(jié)果35-39
• 2.1 STIL蛋白定位在HEK293T細胞核周圍及中心粒上35
• 2.2 STIL突變體E863K和A1047D蛋白表達量較野生型顯著下降35
• 2.3 突變體與野生型的STIL和SUFU相互作用無明顯差異35-36
• 2.4 STIL及SHH通路靶基因m RNA表達下降36-37
• 2.5 STIL基因稀有變異E863K、A1047D引起HEK293T細胞增殖減少37-39
• 討論39-43
• 結(jié)論43-44
• 參考文獻44-49
• 綜述49-56
• 參考文獻53-56
• 致謝56-57
• 在學期間承擔/參與的科研課題與研究成果57-58
• 個人簡歷58

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本文編號：280598