發(fā)布時(shí)間：2020-08-26 17:39

【摘要】：前言癲癇是一種大腦神經(jīng)元放電異常的復(fù)雜的神經(jīng)系統(tǒng)性疾病,發(fā)病率為0.5-1%影響著世界上7000多萬(wàn)病患者。癲癇具有復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制,且其機(jī)制尚未明確。Ca~(2+)/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(Calcium/Calmodulin-dependent protein kinaseⅡ,CaMKII)作為Ca~(2+)/鈣調(diào)蛋白(Calmodulin,CaM)調(diào)節(jié)蛋白家族中的一個(gè)主要成員,其在多種疾病的病理生理過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。研究表明,CaMKII磷酸化活性在不同癲癇模型中下降,我們前期研究結(jié)果表明遺傳性癲癇震顫大鼠(Tremor,TRM)海馬中磷酸化CaMKⅡ蛋白表達(dá)下調(diào)。KN93為CaMKII特異性抑制劑,可抑制CaMKII磷酸化活性。到目前為止,KN93對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用與機(jī)制并不清楚。電壓門控鈉通道(Voltage-gated sodium channel,VGSC)是常見且重要的鈉通道類型之一,其由一個(gè)α亞基和多個(gè)β亞基(β_1-β_4)構(gòu)成,α亞基具有10種不同的亞型(Na_V1.1-1.9,Nax),其中Na_V1.1、Na_V1.2、Na_V1.3和Na _V1.6這4種亞型在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中大量分布。VGSC作為啟動(dòng)神經(jīng)元的動(dòng)作電位,同時(shí)VGSC也是抗癲癇藥物的主要治療靶點(diǎn)。我們既往研究和他人研究表明病人癲癇腦組織和癲癇動(dòng)物模型VGSC的蛋白表達(dá)上調(diào),VGSC功能亦發(fā)生變化。同時(shí),我們前期發(fā)現(xiàn)側(cè)腦室給予KN93的自發(fā)性癲癇大鼠海馬組織中磷酸化CaMKⅡ蛋白表達(dá)進(jìn)一步下調(diào),Na_V1.2蛋白表達(dá)上調(diào),表明CaMKⅡ抑制改變VGSC的表達(dá),可能與癲癇的發(fā)病機(jī)制或繼發(fā)表現(xiàn)相關(guān)。到目前為止,CaMKⅡ活性抑制對(duì)神經(jīng)細(xì)胞VGSC的作用仍不清楚。絲裂原活化蛋白激酶又稱促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK或MAP激酶)是特定于氨基酸、絲氨酸和蘇氨酸的特異性蛋白激酶。MAPK參與指導(dǎo)細(xì)胞對(duì)多種刺激的反應(yīng),例如有絲分裂原、滲透壓、熱休克和促炎細(xì)胞因子。它們調(diào)節(jié)細(xì)胞功能,包括增殖、基因表達(dá)、分化、有絲分裂細(xì)胞存活和細(xì)胞凋亡。c-Jun N-末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)是MAPK的重要通路靶點(diǎn)之一,最初鑒定為激酶結(jié)合并磷酸化c-Jun的上絲氨酸其轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域內(nèi)的-63和Ser-73。它們屬于絲裂原活化蛋白激酶家族,并控制由細(xì)胞因子、紫外線照射、熱休克和滲透壓休克等原因?qū)е碌膽?yīng)激反應(yīng),并在細(xì)胞凋亡途徑中起關(guān)鍵作用。研究表明哺乳動(dòng)物和昆蟲的炎癥反應(yīng)可通過(guò)兩種MAP激酶激酶MKK4和MKK7進(jìn)行活化,并且可以通過(guò)Ser/Thr和Tyr蛋白磷酸酶使JNK失活。本研究使用磷酸化的JNK抑制劑(p-JNK抑制劑)SP600125,我們前期研究中發(fā)現(xiàn)TRM海馬組織p-JNK表達(dá)升高,CaMKII活性抑制后TRM海馬組織p-JNK表達(dá)進(jìn)一步升高,但JNK通路如何影響KN93對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的作用并不明確。因此,本研究通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)、分子生物學(xué)方法揭示KN93對(duì)大鼠原代培養(yǎng)神經(jīng)元和PC12的作用及其機(jī)制,明確KN93對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用及KN93誘導(dǎo)的毒性作用和p-JNK通路之間的關(guān)系,旨在進(jìn)一步闡明癲癇的發(fā)病機(jī)制,為癲癇離子通道特異性藥物的篩選提供初步的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。實(shí)驗(yàn)方法1.傳代細(xì)胞(PC12細(xì)胞系)培養(yǎng)將凍存的細(xì)胞種子37℃復(fù)蘇30分鐘,倒入具有培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中,每6-12h觀察細(xì)胞形態(tài)。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿時(shí)開始傳代,倒出培養(yǎng)皿中的細(xì)胞液,緩慢倒入預(yù)熱的無(wú)血清培養(yǎng)液清洗三次。倒入胰酶消化3-5分鐘(隨時(shí)觀察細(xì)胞狀態(tài)),消化完全后倒入有血清培養(yǎng)液終止消化,并傳至新的培養(yǎng)皿中。取長(zhǎng)好細(xì)胞,重復(fù)細(xì)胞傳代過(guò)程,消化完全后打入2 mL有血清培養(yǎng)液,將細(xì)胞液轉(zhuǎn)移至5 mL EP管中封好,離心后取細(xì)胞沉淀與900μL牛血清馬血清混懸液和100μL凍存液吹打細(xì)胞至均勻,轉(zhuǎn)移至細(xì)胞凍存管,4℃30分鐘,-20℃2小時(shí),-80℃梯度凍存。2.原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)出生2天內(nèi)新生Wistar大鼠幼崽,麻醉并斷頭,迅速取出大腦放入4度存放的Hank’s液中浸泡。在顯微鏡冰浴狀態(tài)下迅速解剖海馬,取用冷藏的5 mL細(xì)胞培養(yǎng)液(Hyclone DME/F-12)清洗海馬組織三次。使用1-2 mL果膠酶消化海馬組織,輕輕吹打1-2次,取出細(xì)胞懸液將剩余組織再次使用果膠酶消化,直至消化完全。將消化后細(xì)胞與海馬神經(jīng)元培養(yǎng)液均勻混合并計(jì)數(shù)進(jìn)行鋪板。24小時(shí)貼壁后每隔一天半數(shù)體積換液。培養(yǎng)7-9天觀察神經(jīng)元狀態(tài)后做實(shí)驗(yàn)。3.免疫印跡(Western Blot,WB)實(shí)驗(yàn)法取出提前鋪好的六孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每板加150μL細(xì)胞裂解液,細(xì)胞刮刀均勻刮培養(yǎng)板至細(xì)胞完全與裂解液混合,靜置30分鐘,將細(xì)胞裂解液吸取至1.5 mL EP管中,12000轉(zhuǎn)20分鐘4℃離心,將細(xì)胞膜細(xì)胞器等雜質(zhì)離心至管底。轉(zhuǎn)移上清至新的1.5 mL EP管中,測(cè)蛋白濃度。按照樣品與Loading Buffer 4:1混勻后放置樣品加熱器中加熱10分鐘,使蛋白變性。制膠后進(jìn)行電泳,75 V低壓電泳30分鐘后切換電壓110 V電泳1小時(shí)。Marker電泳至玻璃板底部停止電泳,取出膠。制轉(zhuǎn)膜三明治,放入冰袋,避光濕轉(zhuǎn)大分子300 mA 6個(gè)小時(shí),小分子200 mA 90分鐘。封閉后膜孵育VGSC亞基兔源一抗抗體和凋亡相關(guān)指標(biāo)一抗抗體,TBST清洗三次每次10分鐘,孵育羊抗兔二抗,TBST清洗三次每次10分鐘。1:1配置ECL發(fā)光液,進(jìn)行發(fā)光。4.CCK8(Cell Counting Kit 8)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)重復(fù)細(xì)胞傳代過(guò)程,在96孔板中接種細(xì)胞懸液,每孔種5000-7000個(gè)細(xì)胞(注意混勻)。細(xì)胞貼壁后,按照0、0.1、0.3、1、3、10、30、100的濃度梯度給藥24小時(shí),終濃度體積為100μL。按1:10加入CCK-8試劑,在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育2小時(shí),用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光值,如果吸光度值不達(dá)標(biāo)每30分鐘再測(cè)一次。CCK8細(xì)胞存活率實(shí)驗(yàn)通過(guò)吸光度值按照細(xì)胞存活率(%)=[A(加藥)-A(空白)]/[A(0加藥)-A(空白)]×100%的公式進(jìn)行計(jì)算。5.流式細(xì)胞術(shù)冰浴條件下,用胰酶消化細(xì)胞,終止消化后離心取細(xì)胞沉淀。取4 mL Binding buffer放入36 mL去離子水中混勻,10倍稀釋Binding buffer試劑。加900μL PBS洗細(xì)胞,將懸液轉(zhuǎn)移到1.5 mL的EP管中,1000轉(zhuǎn)離心5分鐘。離心后去除上清,加950μL Binding buffer輕輕吹打再次離心1000轉(zhuǎn)5分鐘,以上過(guò)程重復(fù)兩次,取出離心后EP管去除上清,每管保留100μL處理后的細(xì)胞懸液。除PI單染和空白對(duì)照組,每管加5μL的FITC(綠),避光染色10分鐘。每管加5μL PI(紅),注意混勻,染完后1小時(shí)內(nèi)測(cè)。加300μL PBS和樣品于流式小管中,標(biāo)記樣本,測(cè)量前吹打勻。染色及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì):PI表示晚期凋亡,FITC染色表示早期凋亡。Q4代表早期凋亡;Q2代表晚期壞死;Q1代表?yè)p傷,一般以Q2+Q4為主。6.免疫熒光培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)先每皿鋪放一張細(xì)胞爬片(WBS),取培養(yǎng)好的神經(jīng)元,4%多聚甲醛固定30分鐘,并用PBS清洗10分鐘三次。3%BSA封閉液封閉30分鐘,取300倍稀釋的NeuN一抗稀釋液(Abcam)50μL 4℃濕盒中孵育一夜。第二天PBS清洗10分鐘三次,100倍稀釋FITC熒光二抗(中杉金橋)50μL敷育兩小時(shí)。PBS清洗10分鐘三次后,DAPI原液染核10分鐘,再次重復(fù)清洗步驟,取出處理好的細(xì)胞爬片,用甘油封片,熒光顯微鏡拍攝NeuN與細(xì)胞核表達(dá)情況。7.統(tǒng)計(jì)分析根據(jù)Western Blot免疫印跡實(shí)驗(yàn)分別將其PVDF膜成像灰度值轉(zhuǎn)換成標(biāo)準(zhǔn)化比值。使用GraphPad 7.0軟件繪制對(duì)照組,KN93加藥組,KN93與TTX共同加藥組和KN93與p-JNK共同加藥組。免疫熒光通過(guò)Image J進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算。使用SPSS軟件評(píng)估數(shù)據(jù)的顯著性差異,統(tǒng)計(jì)方法主要為學(xué)生氏t檢驗(yàn)和方差分析,數(shù)據(jù)為平均值+標(biāo)準(zhǔn)誤,P0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P0.01認(rèn)為具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果1.KN93給藥后24小時(shí)對(duì)細(xì)胞生存率與形態(tài)學(xué)的影響利用CCK8實(shí)驗(yàn)法,應(yīng)用KN93按照0、0.1、0.3、1、3、10、30、100μmol的濃度梯度給藥24小時(shí)后進(jìn)行濃度效應(yīng)曲線測(cè)定。細(xì)胞存活率隨KN93濃度升高而下降,當(dāng)KN93濃度為25μmol時(shí),細(xì)胞存活率為50%即細(xì)胞半數(shù)致死劑量并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=6)。經(jīng)過(guò)KN93給藥后,原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元中通過(guò)免疫熒光染色法發(fā)現(xiàn)NeuN染色的陽(yáng)性細(xì)胞百分比均有下降,從細(xì)胞形態(tài)學(xué)角度證明KN93能導(dǎo)致細(xì)胞死亡。2.KN93給藥后24小時(shí)對(duì)細(xì)胞凋亡的影響在此基礎(chǔ)上,通過(guò)Western Blot實(shí)驗(yàn)法對(duì)凋亡相關(guān)的幾個(gè)通路蛋白進(jìn)行驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)Caspase-3蛋白表達(dá)增加,凋亡通路其他相關(guān)蛋白(BCL-2,Bax,Cytochrome-c)也體現(xiàn)出下降或升高的趨勢(shì),證明KN93給藥后24小時(shí)激活凋亡通路,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(n=6)。根據(jù)蛋白層面表達(dá),對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組利用流式細(xì)胞術(shù)觀察細(xì)胞凋亡程度,發(fā)現(xiàn)25μmol KN93給藥24小時(shí)后細(xì)胞達(dá)到半數(shù)凋亡(n=6)。3.KN93給藥后24小時(shí)對(duì)VGSC的影響為了進(jìn)一步了解24小時(shí)KN93給藥誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的影響,我們研究其對(duì)VGSC四個(gè)亞型Na_V1.1,Na_V1.2,Na_V1.3,Na_V1.6的作用。電壓型門控VGSC四個(gè)亞型KN93給藥處理24小時(shí)后,我們從蛋白層面發(fā)現(xiàn)表達(dá)變化。與對(duì)照組相比Na _V1.1與Na_V1.2兩個(gè)亞型上調(diào),Na_V1.6亞型下調(diào),Na _V1.3有微弱改變但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這一現(xiàn)象表明鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ的抑制劑KN93給藥后24小時(shí)改變VGSC的表達(dá)。4.p-JNK信號(hào)通路參與CaMKⅡ抑制劑KN93誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡KN93給藥后24小時(shí)可作用于p-CaMKII通路,p-JNK為p-CaMKⅡ通路中的下游蛋白,我們應(yīng)用CCK8實(shí)驗(yàn)法分別得出p-JNK抑制劑,p-JNK抑制劑與KN93在不同濃度時(shí)間條件下對(duì)細(xì)胞存活率的影響。通過(guò)免疫熒光技術(shù)在細(xì)胞形態(tài)表達(dá)層面觀察p-JNK抑制劑對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。利用Western Blot實(shí)驗(yàn)法發(fā)現(xiàn)凋亡代表性蛋白Caspase-3表達(dá)下降其他與凋亡通道相關(guān)的上下游抗體蛋白也均有變化,且p-JNK抑制劑(SP600125)可抑制KN93誘導(dǎo)的p-JNK表達(dá)增加。5.p-JNK信號(hào)通路參與CaMKⅡ抑制劑KN93誘導(dǎo)的VGSC表達(dá)異常我們應(yīng)用免疫印跡實(shí)驗(yàn)研究CaMKⅡ抑制劑KN93在蛋白表達(dá)層面對(duì)VGSC四個(gè)亞型Na _V1.1、Na_V1.2、Na_V1.3和Na _V1.6的影響。與KN93給藥后24小時(shí)組比較,p-JNK抑制劑可以降低Na_V1.1和Na_V1.2表達(dá),升高Na_V1.6表達(dá)。結(jié)論與研究意義首先,我們應(yīng)用CCK8測(cè)試不同給藥濃度下的細(xì)胞存活率,之后應(yīng)用熒光染色染色和Western Blot免疫印跡實(shí)驗(yàn)法分別在細(xì)胞形態(tài)層面和蛋白表達(dá)層面觀察給藥對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)KN93給藥后24小時(shí)可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,而不同VGSC亞型對(duì)KN93給藥后24小時(shí)呈現(xiàn)不同表達(dá)。為了進(jìn)一步探究KN93給藥后24小時(shí)作用機(jī)制,應(yīng)用p-JNK抑制劑驗(yàn)證鈣調(diào)蛋白激酶所在通路機(jī)制。數(shù)據(jù)顯示,p-JNK抑制劑對(duì)KN93給藥后24小時(shí)導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡具有逆轉(zhuǎn)作用,并對(duì)VGSC不同亞型具有不同影響,說(shuō)明p-JNK可影響VGSC表達(dá)與細(xì)胞凋亡。綜上所述,我們關(guān)注KN93給藥后24小時(shí)對(duì)VGSC的影響與p-JNK抑制劑對(duì)其細(xì)胞凋亡的逆轉(zhuǎn)和作用機(jī)制。在下一步的工作中,我們進(jìn)一步研究KN93給藥后24小時(shí)誘導(dǎo)的毒性機(jī)制。綜上,本研究揭示KN93毒性作用,初步表明p-JNK通路參與毒性作用機(jī)制,進(jìn)一步揭示癲癇發(fā)病機(jī)制并為尋找抗癲癇藥物的新靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R742.1
【圖文】：

12圖 1 KN93 對(duì)細(xì)胞生存率與形態(tài)學(xué)的影響。(A)KN93 濃度分別為 0.3、1、3、10、30 μM 時(shí)對(duì) PC12細(xì)胞毒性的濃度依賴性曲線；(B)原代海馬神經(jīng)元 NeuN 陽(yáng)性神經(jīng)元在對(duì)照組和 KN93 給藥組中的表達(dá)與定位；(C)PC12 細(xì)胞系和原代培養(yǎng)神經(jīng)元中對(duì)照組與 KN93 給藥組的 WB 代表?xiàng)l帶和統(tǒng)計(jì)圖 *代表與正常組相比， *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.005, ****P<0.0001

14圖 2 KN93 給藥 24h 后對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。(A)PC12 細(xì)胞，正常組與原代培養(yǎng)神經(jīng)元，正常組與 KN93 給藥組 NeuN, Caspase-3, Bcl-2, Bax 及 Cytochrome-c 代表性蛋白條帶；(B)PC12 細(xì)胞系正常組，正常組與 KN93 給藥組 NeuN, Caspase-3, Bcl-2, Bax 及 Cytochrome-c 蛋白相對(duì)灰度值，*代表與正常組相比， *P<0.05, **P<0.01；(C)原代培養(yǎng)神經(jīng)元，正常組與 KN93 給藥組 NeuNCaspase-3, Bcl-2, Bax 及 Cytochrome-c 蛋白相對(duì)灰度值，*代表與正常組相比，*P<0.05, **P<0.01

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文3.3 KN93 對(duì) VGSC 的影響為了進(jìn)一步明確 KN93 給藥 24h 對(duì) VGSC 的影響，我們研究其對(duì) VGSC 中樞神經(jīng)系統(tǒng)四個(gè)亞型 NaV1.1、 NaV1.2、 NaV1.3 與 NaV1.6 的影響。如圖 3 所示，VGSC四個(gè)亞型 KN93 給藥 24h 處理后，蛋白層面發(fā)生變化。與對(duì)照組相比，NaV1.2 亞型在兩種細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)（n=6, *P<0.05 和**P<0.01），NaV1.1、NaV1.3 和 NaV1.6 無(wú)明顯變化 。上述結(jié)果表明 KN93 給藥后 24 小時(shí)導(dǎo)致 VGSC 亞型的異常表達(dá)。

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 羅放;田玉科;;鞘內(nèi)注射KN93對(duì)小鼠神經(jīng)病理性疼痛的鎮(zhèn)痛效應(yīng)[J];臨床麻醉學(xué)雜志;2009年03期

相關(guān)會(huì)議論文 前3條

1 羅放;田玉科;;鞘內(nèi)注射KN93對(duì)小鼠神經(jīng)病理性疼痛的鎮(zhèn)痛作用[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)疼痛學(xué)分會(huì)第七屆年會(huì)論文摘要集[C];2007年

2 王千慧;蔡際群;郝麗英;郭鳳;;CaMKⅡ抑制劑KN93對(duì)遺傳性癲癇大鼠海馬電壓門控性鈉通道亞型NaV1.1,NaV1.2表達(dá)的影響[A];中國(guó)生理學(xué)會(huì)第24屆全國(guó)會(huì)員代表大會(huì)暨生理學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)論文匯編[C];2014年

3 羅放;田玉科;;鞘內(nèi)注射KN93對(duì)小鼠慢性炎性痛的鎮(zhèn)痛作用[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)疼痛學(xué)分會(huì)第七屆年會(huì)論文摘要集[C];2007年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 張展翅;磁刺激對(duì)小鼠原代海馬神經(jīng)元突觸可塑性相關(guān)蛋白和鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制影響的研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2012年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 趙東儀;鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ的抑制劑KN93對(duì)大鼠海馬培養(yǎng)神經(jīng)元與PC12細(xì)胞的毒性作用與機(jī)制[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2019年

2 丁翔;大鼠原代培養(yǎng)心房肌細(xì)胞鈣超載模型建立及CaMKⅡ抑制劑KN93的干預(yù)作用研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2010年

本文編號(hào)：2805484