【摘要】：目的 通過特異性的不同內(nèi)吞途徑化學(xué)阻斷劑研究EV71入侵人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SK-N-SH機(jī)制，從而為探討EV71感染神經(jīng)系統(tǒng)損傷的致病機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)為臨床抗病毒治療及疫苗的研發(fā)開辟新的思路。 材料與方法 1.病毒來源 本實(shí)驗(yàn)所需的EV71，由重慶市疾病預(yù)防控制中心微生物檢測(cè)所(病毒檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室)提供。 2.細(xì)胞來源 本實(shí)驗(yàn)所需的腫瘤細(xì)胞即人橫紋肌肉瘤細(xì)胞株（RD）由重慶市疾病預(yù)防控制中心微生物檢測(cè)所(病毒檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室)提供。人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞（SK-N-SH）由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院兒研所組織細(xì)胞培養(yǎng)室提供。 3.實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分為4組，有空白組、陰性對(duì)照組、氯丙嗪(Chlorpromazine,CPZ)處理組、制霉菌素（Nystatin,NT）處理組。CPZ處理組采用10、15、20μΜ藥物；NT處理組給予10、15、20μg/ml的藥物；對(duì)照組不作藥物預(yù)處理；空白組不作任何處理。各組分別預(yù)處理SK-N-SH細(xì)胞1h，然后EV71病毒株感染靶細(xì)胞1h，最后細(xì)胞培養(yǎng)在含有阻斷劑的相應(yīng)的培養(yǎng)基中。24小時(shí)后，收集細(xì)胞，TaqMan熒光定量RT-PCR驗(yàn)證EV71mRNA的表達(dá)。 4.實(shí)驗(yàn)方法 4.1EV71病毒培養(yǎng)、增殖及滴度的測(cè)定。 4.2MTT法檢測(cè)不同胞吞途徑化學(xué)阻斷劑對(duì)細(xì)胞增殖的影響。 4.3TaqMan熒光定量RT-PCR驗(yàn)證EV71mRNA的表達(dá)情況。 結(jié)果 1.本實(shí)驗(yàn)成功地?cái)U(kuò)增出EV71病毒，病毒滴度為1×105TCID50。 2. MTT法檢測(cè)到隨著藥物濃度梯度的增加，SK-N-SH細(xì)胞的增殖受到抑制。 3. TaqMan熒光定量RT-PCR結(jié)果表明SK-N-SH細(xì)胞易感于腸道病毒EV71型。 4. TaqManQPCR結(jié)果顯示CPZ能夠抑制EV71mRNA的表達(dá)（Ρ〈0.05），NT對(duì)其影響不大（Ρ〉0.05）。 結(jié)論 初步推測(cè)EV71入侵SK-N-SH細(xì)胞是通過網(wǎng)格蛋白依賴性的內(nèi)吞作用入胞。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R739.4
【圖文】：

正常 RD 細(xì)胞 出現(xiàn) CPE 的 RD 細(xì)胞圖 1 EV71 病毒感染 RD 細(xì)胞 24 h 后的 CPE(×100)Fig.1 The CPE of EV71 infecting RD cells after 24 h(×100).2 病毒滴度測(cè)定采用 Karber 法計(jì)算病毒滴度：病毒液稀釋度 出現(xiàn) CPE 孔數(shù) 出現(xiàn) CPE 孔的比率10-18 8/8=110-28 8/8=110-38 8/8=110-48 8/8=110-57 7/8=0.875μ ｍ

0.5)=1-1*（6.125-0.5）=-4.625.1ml4.625，接種 100μl，可使 50%的細(xì)胞發(fā)生病變。得病毒滴度為 1*104.625TCID50 檢測(cè) EV71mRNA 的表達(dá)果顯示在 226bp 處可見 2 條清晰的條帶，而陰性對(duì)照組帶，證實(shí) EV71 感染 RD 細(xì)胞可以擴(kuò)增出 EV71 病毒特M 1 2 3 400

濃度的氯丙嗪作用靶細(xì)胞 1h后，與對(duì)照組相比,藥物組OD值降OD 值下降明顯（Ρ=0.025；Ρ=0.000），根據(jù)公式計(jì)算出各濃度梯長(zhǎng)的相對(duì)抑制率,發(fā)現(xiàn) 80μΜCPZ 對(duì) SK-N-SH 細(xì)胞有明顯的抑制學(xué)意義（Ρ=0.001）(見表 1.1，圖 1.1)。表 1.1 氯丙嗪作用不同濃度各組細(xì)胞 OD 值（ x ±s,n=3）Tab.1.1 The OD value of cells functioned by different concentratioChlorpromazine（ ±,n=3）物分組 濃度 OD 值 Ρ 值性對(duì)照組(PBS)100.91±0.140.88±0.11 0.734PZ(μΜ) 20 0.85±0.14 0.57240 0.63±0.16 0.02580 0.14±0.04 0.000

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 徐廣振;李明;李晉濤;;EV71的受體研究進(jìn)展[J];病毒學(xué)報(bào);2011年01期

本文編號(hào)：2756398