【摘要】：膠質(zhì)瘤是成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最普遍的原發(fā)性惡性腫瘤,具有復(fù)發(fā)率高、致死率高、預(yù)后差的特點(diǎn)。盡管目前國內(nèi)外治療膠質(zhì)瘤采用手術(shù)后輔助放化療的綜合治療方案,但是,絕大多數(shù)惡性膠質(zhì)瘤尤其是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的預(yù)后并沒有得到顯著改善。因此,深入研究膠質(zhì)瘤發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制對(duì)防治膠質(zhì)瘤,提高患者生存期具有重要意義。膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的多基因相互作用和多分子相互調(diào)節(jié)的過程。Circular RNA(circRNA,環(huán)狀RNA)作為非編碼RNA中的一顆新星,引發(fā)了越來越多國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注,研究表明circRNA可充當(dāng)競爭性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA),作為miRNA海綿吸附miRNA在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控下游目的基因的表達(dá),進(jìn)而參與多種腫瘤的生物學(xué)行為調(diào)控。MicroRNA是一組約22個(gè)核苷酸的單鏈非編碼RNA,其通過與其靶基因mRNA的3'-非翻譯區(qū)(3'-UTR)結(jié)合而負(fù)調(diào)控轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá),進(jìn)而參與多種細(xì)胞功能。MiR-496在肺腺癌中起到抑癌基因的作用,此外miR-496還參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展并與前列腺癌預(yù)后不良相關(guān)。RFX3(Regulatory factor X3)是調(diào)節(jié)因子X基因家族中的一員。研究表明,RFX3可結(jié)合FGF1的啟動(dòng)子區(qū),調(diào)控促進(jìn)FGF1的表達(dá),進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞增殖和神經(jīng)發(fā)生。此外,RFX3還能促進(jìn)FGF8的表達(dá),參與腦的早期發(fā)育。DEF6(又稱Interferon regulatory factor 4 binding protein,IBP)在多種腫瘤中異常表達(dá),并與骨外粘液軟骨肉瘤、結(jié)直腸癌、乳腺癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。本研究旨在闡明Hsa-circ-001193與miR-496、miR-496與RFX3、RFX3與DEF6之間的調(diào)控關(guān)系,以及對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為的作用與分子機(jī)制。研究方法:首先培養(yǎng)人的膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87、U251,人正常星型膠質(zhì)細(xì)胞,和人胚腎細(xì)胞HEK293。應(yīng)用Real-time PCR檢測Hsa-circ-001193、miR-496,應(yīng)用Western blot檢測RFX3和DEF6,在正常腦組織、膠質(zhì)瘤組織、人正常星型膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)水平。應(yīng)用CCK-8檢測細(xì)胞增殖能力。采用Transwell檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力的變化。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。應(yīng)用通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法構(gòu)建Hsa-circ-001193、mi R-496、RFX3和DEF6過表達(dá)和表達(dá)沉默的細(xì)胞系。Real-time PCR方法檢測Hsa-circ-001193、mi R-496、RFX3和DEF6的表達(dá)變化。Western Blot方法檢測RFX3、DEF6、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT蛋白的表達(dá)變化。雙熒光素酶基因報(bào)告系統(tǒng)檢測miR-496和RFX3的靶向結(jié)合及結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶基因報(bào)告系統(tǒng)和RNA免疫沉淀實(shí)驗(yàn)檢測Hsa-circ-001193和miR-496的靶向結(jié)合及結(jié)合位點(diǎn)。應(yīng)用染色質(zhì)免疫共沉淀法檢測RFX3和DEF6啟動(dòng)子的直接作用。裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)檢測Hsa-circ-001193和mi R-496對(duì)裸鼠移植瘤的生長和荷瘤裸鼠生存時(shí)間的影響。結(jié)果:Hsa-circ-001193在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中內(nèi)源性表達(dá),且在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中表達(dá)顯著上調(diào)。沉默Hsa-circ-001193顯著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖,遷移和侵襲能力,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。MiR-496在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中內(nèi)源性表達(dá),且在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中表達(dá)顯著下調(diào)。過表達(dá)miR-496顯著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖,遷移和侵襲能力,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Hsa-circ-001193與miR-496存在靶向結(jié)合作用。沉默Hsa-circ-001193或過表達(dá)miR-496降低RFX3的表達(dá)。RFX3在膠質(zhì)瘤組織和膠質(zhì)瘤細(xì)胞中內(nèi)源性表達(dá),且在膠質(zhì)瘤組織和膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)顯著上調(diào)。沉默Hsa-circ-001193通過負(fù)性調(diào)控miR-496,降低RFX3的表達(dá),抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖,遷移和侵襲能力,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。沉默RFX3顯著抑制U87和U251細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。RFX3與DEF6的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合,增加其啟動(dòng)子活性。DEF6在膠質(zhì)瘤組織和膠質(zhì)瘤細(xì)胞中內(nèi)源性表達(dá),且在膠質(zhì)瘤組織和膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)顯著上調(diào)。沉默DEF6顯著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖,遷移和侵襲能力,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。過表達(dá)miR-496通過負(fù)性調(diào)控RFX3的表達(dá),降低DEF6的表達(dá),進(jìn)而調(diào)控PI3K/AKT通路活性,調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。結(jié)論:1.Hsa-circ-001193、RFX3和DEF6在膠質(zhì)瘤組織和膠質(zhì)瘤細(xì)胞中高表達(dá),miR-496在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中低表達(dá)。沉默Hsa-circ-001193、RFX3和DEF6,以及過表達(dá)miR-496抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。2.Hsa-circ-001193靶向結(jié)合miR-496,miR-496負(fù)性調(diào)控RFX3的表達(dá);RFX3與DEF6的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合,促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄,調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。3.沉默Hsa-circ-001193與過表達(dá)miR-496的聯(lián)合應(yīng)用顯著抑制裸鼠移植瘤生長,延長其生存期。
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R739.41

【參考文獻(xiàn)】

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1 彭健;miR-496靶向Wnt/β-catenin通路抑制骨肉瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移[D];南華大學(xué);2015年

本文編號(hào)：2734429