發(fā)布時(shí)間：2020-06-28 12:13

【摘要】：研究背景Akt,也稱為蛋白激酶B(PKB),是哺乳動(dòng)物絲氨酸/蘇氨酸特定蛋白激酶的家族成員,包括Akt1,Akt2、Akt3三種亞型。Akt對(duì)諸多生理過(guò)程都具有重要的調(diào)節(jié)作用。既往研究發(fā)現(xiàn)Akt1基因敲除(Akt1-KO)小鼠生長(zhǎng)遲緩;Akt3基因敲除(Akt3-KO)小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力受損。但是有關(guān)Akt3缺失損害空間認(rèn)知的機(jī)制迄今還不清楚。海馬CA1區(qū)頻率依賴性長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)誘導(dǎo)被認(rèn)為是學(xué)習(xí)和記憶功能的細(xì)胞模型。按照高頻刺激后興奮性突觸后膜電位(EPSP)斜率增加的時(shí)間又可以把LTP分為早期-LTP(細(xì)胞內(nèi)激酶活性機(jī)制)和晚期-LTP(棘突內(nèi)蛋白合成機(jī)制)。前者可能與AMPA受體(AMPAr)亞基Glu A1和Glu A2的磷酸化增強(qiáng)有關(guān),而后者可能與AMPA受體等多種膜蛋白合成增加有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn),m TOR抑制劑雷帕霉素的使用能阻止晚期-LTP的產(chǎn)生,但不影響早期-LTP的誘導(dǎo)。由于Akt3的缺失能減少m TOR的磷酸化水平,而Akt1的缺失不影響m TOR的磷酸化水平,因此本課題提出“Akt3缺失通過(guò)抑制m TOR-p70S6k信號(hào)通路,影響蛋白合成依賴性LTP的產(chǎn)生,導(dǎo)致認(rèn)知障礙”的科研假設(shè)。研究目的1.探討Akt1和Akt3缺失對(duì)小鼠空間認(rèn)知和海馬突觸可塑性的影響。2.明確Akt1和Akt3缺失影響海馬突觸可塑性的分子機(jī)制。材料與方法1.Akt基因敲除小鼠由南京大學(xué)模式動(dòng)物中心的陳貴泉教授贈(zèng)送。用PCR方法鑒定Akt1基因敲除小鼠(Akt1-KO小鼠)和Akt3基因敲除小鼠(Akt3-KO小鼠)。Akt1-KO小鼠的野生型(WT)同窩小鼠被稱為Akt1-WT小鼠。Akt3-KO小鼠的野生型(WT)同窩小鼠被稱為Akt3-WT小鼠。本課題使用12周齡的Akt1-KO小鼠、Akt1-WT小鼠、Akt3-KO小鼠和Akt3-WT小鼠。2.認(rèn)知行為檢測(cè)試驗(yàn):用開(kāi)場(chǎng)試驗(yàn)檢測(cè)小鼠的自發(fā)性活動(dòng);用Y-迷宮和Morris水迷宮試驗(yàn)檢查小鼠的空間認(rèn)知記憶功能。3.用甲苯胺藍(lán)染色觀察海馬CA1區(qū)的組織結(jié)構(gòu)和錐體細(xì)胞。4.采用場(chǎng)電位記錄海馬CA區(qū)的謝弗側(cè)枝-CA1突觸傳遞功能和突觸可塑性LTP的誘導(dǎo)。用100Hz的高頻刺激(HFS)誘導(dǎo)LTP。采用一次性HFS(HFS×1)和連續(xù)4次HFS(HFS×4,間隔5分鐘)的方式。高頻刺激后60分鐘記錄視為早期-LTP,180分鐘記錄視為晚期-LTP。5.用免疫印跡分析法檢測(cè)海馬腦區(qū)的Ca MKII、ERK1/2、m TOR、p70S6k、4EBP2和e IF4E的磷酸化水平和蛋白水平,AMPA受體亞基Glu R1和Glu R2的蛋白水平。第一部分試驗(yàn)結(jié)果1.開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)(OFT)中,Akt3-WT小鼠和Akt3-KO小鼠的總行程無(wú)顯著性差異。與Akt1-WT小鼠相比,Akt1-KO小鼠的總行程也沒(méi)有發(fā)生改變。2.Y-迷宮試驗(yàn)結(jié)果顯示,與Akt3-WT小鼠相比,Akt3-KO小鼠有較低的交替率,但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與Akt1-WT小鼠相比,Akt1-KO小鼠的交替率也沒(méi)有改變。與Akt3-WT小鼠或Akt1-WT小鼠相比,Akt3-KO小鼠和Akt1-KO小鼠在Y-迷宮試驗(yàn)的進(jìn)臂次數(shù)都沒(méi)有顯著差異。3.Morris水迷宮任務(wù)結(jié)果顯示,在訓(xùn)練第1-2天的明臺(tái)試驗(yàn)中,Akt3-WT小鼠和Akt3-KO小鼠尋找可視平臺(tái)的潛伏期沒(méi)有差異。同樣,Akt1-WT小鼠和Akt1-KO小鼠的明臺(tái)試驗(yàn)潛伏期也沒(méi)有差異。在訓(xùn)練第3-7天的暗臺(tái)試驗(yàn)中,Akt3-KO小鼠尋找到暗臺(tái)的潛伏期較Akt3-WT小鼠明顯延長(zhǎng),但是Akt1-WT小鼠和Akt1-KO小鼠在暗臺(tái)試驗(yàn)中的登臺(tái)潛伏期并沒(méi)有差異。在第8天的軌跡試驗(yàn)中,與Akt3-WT小鼠相比,Akt3-KO小鼠在平臺(tái)象限的游泳時(shí)間,以及穿梭和停留時(shí)間都明顯減少。但是Akt1-WT小鼠和Akt1-KO小鼠在軌跡試驗(yàn)的平臺(tái)象限游泳時(shí)間沒(méi)有差異。與Akt3-WT小鼠或Akt1-WT小鼠相比,Akt3-KO小鼠和Akt1-KO小鼠在Morris水迷宮中的游泳速度都沒(méi)有顯著差異。4.與Akt3-WT小鼠、Akt1-WT小鼠相比,Akt3-KO小鼠和Akt1-KO小鼠腦的總量減輕,但是海馬結(jié)構(gòu)沒(méi)有明顯異常,海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞的密度未見(jiàn)顯著性差異。5.與Akt3-WT小鼠或Akt1-WT小鼠相比,刺激謝弗側(cè)枝記錄到CA1區(qū)興奮性突觸后電位(EPSP)的斜率在Akt3-KO小鼠和Akt1-KO小鼠都沒(méi)有明顯改變。同樣,雙脈沖刺激誘導(dǎo)的雙脈沖易化(PPF)比率在Akt3-KO小鼠和Akt1-KO小鼠也未見(jiàn)差異。6.在Akt3-KO小鼠和Akt1-KO小鼠,HFS×1條件刺激能誘導(dǎo)早期-LTP。Akt1-KO小鼠早期-LTP的幅值要略低于Akt1-WT小鼠。NMDA受體拮抗劑MK801能阻斷Akt3-WT小鼠和Akt3-KO小鼠早期-LTP的誘導(dǎo)。7.在Akt1-KO小鼠,HFS×4條件刺激可以誘導(dǎo)晚期-LTP,但是晚期-LTP幅值低于Akt1-WT小鼠。在Akt3-KO小鼠,HFS×4條件刺激不能誘導(dǎo)晚期-LTP。在Akt3-WT小鼠,MK801不能阻斷晚期-LTP誘導(dǎo),而m TOR抑制劑雷帕霉素能阻斷晚期-LTP誘導(dǎo)。第二部分試驗(yàn)結(jié)果1.與Akt3-WT小鼠或Akt1-WT小鼠相比,Akt3-KO小鼠和Akt1-KO小鼠海馬Ca MKII和ERK2磷酸化水平和蛋白水平都沒(méi)有明顯差異。在HFS×1刺激5分鐘后,Akt3-WT小鼠、Akt1-WT小鼠、Akt3-KO小鼠和Akt1-KO小鼠Ca MKII和ERK2磷酸化水平都有明顯增加,但是Akt1-KO小鼠的增加幅值明顯低于Akt1-WT小鼠。此外,MK801能阻斷HFS×1誘導(dǎo)Ca MKII和ERK2磷酸化增加。2.在HFS×4刺激5分鐘后,Akt3-KO小鼠和Akt1-KO小鼠Ca MKII和ERK2磷酸化的增加幅值與Akt3-WT小鼠和Akt1-WT小鼠相比沒(méi)有差異。3.與Akt3-WT小鼠相比,Akt3-KO小鼠基礎(chǔ)m TOR磷酸化或者HFS×1刺激5分鐘后m TOR磷酸化水平都明顯降低,而m TOR蛋白水平?jīng)]有明顯改變。HFS×4刺激可以增加Akt3-WT小鼠的m TOR磷酸化水平,但是不增加Akt3-KO小鼠的。PI3K抑制劑LY294002能阻斷HFS×4誘導(dǎo)m TOR磷酸化水平增加。與Akt1-WT小鼠相比,Akt1-KO小鼠基礎(chǔ)m TOR磷酸化,HFS×1和HFS×4刺激后的m TOR磷酸化水平,以及m TOR蛋白水平都沒(méi)有明顯改變。4.與Akt3-WT小鼠和Akt1-WT小鼠相比,Akt3-KO小鼠和Akt1-KO小鼠的基礎(chǔ)p70s6k磷酸化、HFS×1刺激5分鐘后的p70s6k磷酸化水平都沒(méi)有明顯改變。HFS×4刺激可以增加Akt3-WT小鼠的p70s6k磷酸化水平,但是不增加Akt3-KO小鼠的。LY294002能阻斷HFS×4誘導(dǎo)p70s6k磷酸化水平增加。與Akt3-WT小鼠和Akt1-WT小鼠相比,Akt3-KO小鼠和Akt1-KO小鼠的基礎(chǔ)4EBP2和e IF4E磷酸化,HFS×1刺激5分鐘后的4EBP2和e IF4E磷酸化水平都沒(méi)有明顯改變。HFS×4刺激可以增加Akt3-WT小鼠的4EBP2和e IF4E磷酸化,但是不影響Akt3-KO小鼠的4EBP2和e IF4E磷酸化水平。LY294002和雷帕霉素能阻斷HFS×4誘導(dǎo)4EBP2和e IF4E磷酸化增加。5.HFS×4刺激后180分鐘后,在Akt3-WT小鼠,Akt1-WT小鼠和Akt1-KO小鼠AMPA受體亞基Glu R1和Glu R2的蛋白水平顯著增加,但是在Akt3-KO小鼠沒(méi)有增加。結(jié)論Akt3缺失通過(guò)阻止高頻刺激激活海馬神經(jīng)元m TOR-p70S6k信號(hào)通路,抑制4EBPs和e IF4E磷酸化啟動(dòng)AMAP受體等棘突蛋白合成,損害晚期-LTP產(chǎn)生,導(dǎo)致認(rèn)知功能減退。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R741

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