【摘要】：背景:研究表明,長期應(yīng)激條件的刺激可以引起實驗動物的異常行為并增加了人類患心理疾病的風險。除此之外,應(yīng)激環(huán)境的慢性刺激會加速大腦老化,記憶力衰減并最終導致神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生。糖皮質(zhì)激素是下丘腦-垂體-腎上腺軸受應(yīng)激刺激時分泌的主要激素,糖皮質(zhì)激素類作為臨床治療藥物在臨床上的使用也非常廣泛,尤其是用于對自身免疫性疾病和部分內(nèi)分泌疾病的患者,這些患者均會有長期使用糖皮質(zhì)激素的需求。研究表明應(yīng)激激素皮質(zhì)醇的升高和人類衰老過程中顳葉萎縮以及認知缺陷密切相關(guān),另外臨床數(shù)據(jù)表明伴有皮質(zhì)醇水平升高的患者出現(xiàn)認知功能障礙和記憶衰退的癥狀早于同齡對照組患者。長期使用糖皮質(zhì)激素類藥物如地塞米松可損傷人類或嚙齒類動物的記憶能力增加人體患神經(jīng)退行性疾病的風險。臨床數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)神經(jīng)退行性疾病患者(如阿爾茲海默爾癥患者)體內(nèi)皮質(zhì)醇水平高于同齡組皮質(zhì)醇平均水平,目前文獻報道的長期使用糖皮質(zhì)激素增加患神經(jīng)退行性疾病風險的機制包括腦神經(jīng)分泌因子的減少、氧化應(yīng)激反應(yīng)的出現(xiàn),以及對神經(jīng)細胞突起結(jié)構(gòu)功能的改變。值得注意的是目前臨床上尚沒有發(fā)現(xiàn)有效對抗這種神經(jīng)系統(tǒng)損傷的藥物,一是由于中樞神經(jīng)細胞具有不可再生性的特點;二是由于目前大部分被發(fā)現(xiàn)的具有神經(jīng)保護性的物質(zhì)都是大分子物質(zhì)或者非脂溶性物質(zhì),無法通過血腦屏障。五味子(Schisandra chinensis,SCH)屬于木蘭科植物,五味子作為傳統(tǒng)中藥藥材具有增強智力和改善心理的作用,常用于治療病毒性肝炎、化學性肝炎以及心肌疾病。五味子發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)作用、抗氧化反應(yīng)作用的主要成分是聯(lián)苯環(huán)辛二烯木脂素。五味子甲素、五味子乙素和五味子醇甲是從五味子中提取的主要有效成分,通過結(jié)構(gòu)分析得知五味子甲素、五味子乙素和五味子醇甲均是聯(lián)苯環(huán)辛二烯衍生物。五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素作為小分子脂溶性物質(zhì)可以通過血腦屏障,五味子中的這種小分子結(jié)構(gòu)為其可作為神經(jīng)營養(yǎng)作用藥物提供了支持。從動物模型體內(nèi)和體外的實驗中證明,無論對由東莨菪堿引起的健忘癥,淀粉樣β樣蛋白引起的神經(jīng)毒性、順鉑誘導的氧化應(yīng)激傷害還是基因表達異常引起的神經(jīng)毒性,五味子醇甲表現(xiàn)有神經(jīng)保護作用。文獻報道五味子醇甲作為五味子果實中的主要活性成分具有安定、抗驚以及腦保護作用;然而,五味子醇甲對抗糖皮質(zhì)激素所致的神經(jīng)元損傷其可能的作用機制尚不明確。因此研究五味子醇甲在改善糖皮質(zhì)激素所致的神經(jīng)元損傷中的作用機制具有重要的研究價值。目的:通過體外實驗探討五味子醇甲是否對糖皮質(zhì)激素所致的神經(jīng)元損傷有保護作用,并發(fā)現(xiàn)其可能的作用機制,為臨床治療相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)損傷提供理論依據(jù)。方法:實驗從新生24小時以內(nèi)的SD大鼠的腦組織皮層中提取神經(jīng)元,體外培養(yǎng)3天,觀察神經(jīng)元突起生長狀況;通過NSE實驗和MAP2免疫熒光染色實驗對提取的神經(jīng)元進行鑒定,進一步確認神經(jīng)元的形態(tài)及純度,以及不同規(guī)格的培養(yǎng)皿的最優(yōu)細胞種植密度;提取的神經(jīng)元每三天換一次液,體外培養(yǎng)9天后,將神經(jīng)元分為對照組和地塞米松處理組;用不同濃度的地塞米松(10~(-4)、10~(-5)、10~(-6)、10~-77 mol/L)繼續(xù)作用神經(jīng)元3天,MTT實驗鑒定地塞米松處理過的神經(jīng)元的活性;結(jié)合實時熒光定量實驗PCR技術(shù)和免疫熒光染色技術(shù),檢測分組的神經(jīng)元MAP2 mRNA的表達差異以及觀察神經(jīng)元突起的生長狀態(tài),最終確認實驗中采取的地塞米松藥物的適宜濃度。提取的神經(jīng)元經(jīng)過9天的體外培養(yǎng)后,將神經(jīng)元分為對照組、地塞米松損傷組以及地塞米松損傷加不同濃度(40、80和160μmol/L)的五味子醇甲處理的實驗組,繼續(xù)培養(yǎng)三天;提取神經(jīng)元的蛋白和RNA,通過western blot和實時熒光定量PCR以及免疫熒光實驗探尋五味子醇甲對損傷的神經(jīng)元可能的保護效應(yīng)及機制。結(jié)果:1原代神經(jīng)元經(jīng)過3天的體外培養(yǎng),根據(jù)觀察到的神經(jīng)突起生成情況,MAP2免疫熒光染色實驗和NSE染色鑒定神經(jīng)元的純度和生長狀態(tài),發(fā)現(xiàn)接種神經(jīng)細胞最優(yōu)的密度為6孔板為100萬/孔,12孔板為25萬/孔,24孔板為8萬/孔,96孔板為4萬/孔。MTT結(jié)果地塞米松處理72小時后,10~(-4)和10~-55 mol/L的地塞米松處理組的神經(jīng)元的存活率降低,MAP2抗體免疫熒光染色實驗進一步顯示神經(jīng)元的突起在10~(-4)和10~-55 mol/L的地塞米松處理的情況下,神經(jīng)元神經(jīng)纖維纏結(jié)明顯,部分神經(jīng)纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)甚至崩解。所以確定有效的損傷濃度是10~(-4)和10~(-5)mol/L的地塞米松;在10~(-6)和10~-77 mol/L低濃度地塞米松處理濃度處理的情況下神經(jīng)突起纏繞不明顯,不能有效的損傷神經(jīng)元。2神經(jīng)元體外培養(yǎng)9天后,同時加入地塞米松和五味子醇甲,MTT實驗結(jié)果顯示神經(jīng)元存活率降低;MAP2免疫熒光染色結(jié)果顯示加入五味子醇甲后的神經(jīng)元突起纏繞情況得到緩解,神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)崩解情況較少。3 western blot實驗檢測神經(jīng)元突觸后致密蛋白的表達情況,結(jié)果顯示與空白組和溶劑對照組相比,地塞米松處理組的神經(jīng)元突觸后致密蛋白PSD95的表達下調(diào);tau蛋白的磷酸化水平增強,tau不同位點(ser199,ser202,ser396)的磷酸化水平升高;實時熒光定量PCR實驗結(jié)果顯示對空白對照組和溶劑對照組相比較,地塞米松處理組MAP2mRNA的表達量下降,葡萄糖轉(zhuǎn)運體3(GLU3)mRNA的表達量下降。4在地塞米松作用神經(jīng)元細胞的同時加入五味子醇甲作用細胞三天,Western Blot結(jié)果顯示與地塞米松處理組相比,加入五味子醇甲后神經(jīng)元細胞的突出后致密蛋白PSD95的表達增強,并表現(xiàn)為一定的五味子醇甲劑量依賴性,tau蛋白磷酸化水平降低,tau蛋白不同位點的抗磷酸化水平增強;實時熒光定量PCR結(jié)果顯示,與地塞米松作用組相比較,五味子醇甲的加入可使神經(jīng)元細胞MAP2 mRNA的表達量上調(diào),葡萄糖轉(zhuǎn)運體3的mRNA表達量增強。結(jié)論:五味子醇甲對糖皮質(zhì)激素引起的神經(jīng)損傷有一定的保護作用,其可能機制一是使神經(jīng)元膜表面葡萄糖轉(zhuǎn)運體3 mRNA的表達上調(diào),加速葡萄糖的轉(zhuǎn)運,為tau蛋白糖基化提供更多的底物,提高tau蛋白的糖基化水平,從而降低tau蛋白磷酸化水平;二是五味子醇甲通過增加突觸周致密蛋白PSD95的表達量對神經(jīng)元的突觸有一定的保護作用。
【學位授予單位】：河南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R741
【圖文】：

糖皮質(zhì)激素和記憶的倒U型劑量反應(yīng)曲線圖，虛線所指計量為最佳的鞏固記憶的糖皮質(zhì)激素水平，注意這個峰值可能會根據(jù)記憶的類型和階段和個體差異而改變

圖 2：糖皮質(zhì)激素促進神經(jīng)退行性疾病發(fā)生可能的慢性作用機制。五味子屬有大約 30 個種類，五味子為其中的一種是多年生植物，主要生長在韓國東北地區(qū)、中國、日本以及俄羅斯的東部地區(qū)[15]。五味子是一個重要的藥用植物，在統(tǒng)的藥物中，五味子的果實一直被用于治療多種機體功能紊亂癥狀，包括腎臟感染、

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本文編號：2726602