發(fā)布時間：2020-05-24 01:06

【摘要】：腦膠質(zhì)瘤是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤,膠質(zhì)母細(xì)胞瘤被視為最具侵襲性的惡性膠質(zhì)瘤。microRNA(miRNA)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類長度為19—25個核苷酸的非編碼小分子RNA,通過與靶mRNA的3’非翻譯區(qū)(3'-UTR)不完全互補配對,導(dǎo)致靶標(biāo)mRNA降解或轉(zhuǎn)錄后翻譯抑制,從而參與個體發(fā)育、細(xì)胞凋亡、增殖及分化等生理過程。這些miRNAs的缺失或者異常表達(dá)可能與疾病密切相關(guān),包括腫瘤。但是miRNA引起腫瘤的發(fā)生發(fā)展的具體機制不明。本課題小組前期已檢測到人巨細(xì)胞病毒HCMV感染對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響,并有數(shù)據(jù)顯示HCMV感染后miR-141-3p表達(dá)量明顯降低。因而,我們推測:HCMV通過調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)miRNA的表達(dá),影響膠質(zhì)瘤中控制細(xì)胞增殖、凋亡的關(guān)鍵蛋白,進而調(diào)控腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的惡性程度。本實驗通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),miR-141-3p與轉(zhuǎn)錄激活因子5(Activating transcription factor 5,ATF5)mRNA3’-UTR區(qū)域存在堿基互補配對。為了進一步提高預(yù)測的可靠性,我們又利用BiBiServe RNA hybrid algorithm檢測miR-141及其家族成員與ATF5 3’-UTR結(jié)合的最小自由能。預(yù)測結(jié)果顯示,miR-141與ATF5 3’-UTR區(qū)結(jié)合的自由能為-74.0kcal/mol,并且在種子區(qū)有連續(xù)7個核苷酸完全互補。然后,我們構(gòu)建了含ATF53’-UTR區(qū)的報告質(zhì)粒,應(yīng)用熒光素酶報告基因?qū)嶒炦M一步驗證miR-141-3p與ATF53’-UTR靶向結(jié)合。以神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織樣本和細(xì)胞為研究對象,熒光定量PCR檢測miR-141-3p和ATF5表達(dá)水平,并檢測了miR-141-3p對ATF5 mRNA和蛋白表達(dá)的影響。數(shù)據(jù)顯示,miR-141-3p能夠降低ATF5 mRNA和蛋白的表達(dá)。通過CCK8實驗和Annexin V-PE/7-AAD方法檢測膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞凋亡情況,進一步發(fā)現(xiàn)miR-141-3p負(fù)調(diào)控ATF5,從而抑制細(xì)胞增殖、促進細(xì)胞凋亡。我們的結(jié)果顯示,miR-141-3p的種子序列對于其與ATF5 3’-UTR結(jié)合形成二級結(jié)構(gòu)極為重要,這種結(jié)合作用抑制了ATF5的進一步翻譯。這不僅為靶向膠質(zhì)瘤治療提供新的可能靶點,也為明確膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展機制提供新的理論和實驗依據(jù)。同時預(yù)示著,HCMV感染很可能利用調(diào)控多種microRNA的表達(dá)來增強腫瘤細(xì)胞的持續(xù)增殖,以便為持續(xù)感染創(chuàng)造條件。這將是我們課題組接下來的研究重點。
【圖文】：

體系：表 3.1 PCR 反應(yīng)體系 體 Master Mix (2X) 10μM） 10μM） 5℃ 5 min預(yù)變性，循環(huán)內(nèi) 95 ℃ 1)；72℃延伸 10 min。取 5 μL PC3.1），PCR 擴增產(chǎn)物大小符合預(yù)期

圖 3.3 電轉(zhuǎn)裝置將電轉(zhuǎn)儀置于冰上，按照正負(fù)極安裝電轉(zhuǎn)裝置，電轉(zhuǎn)槽中加源，設(shè)定電流為 130mA。疫反應(yīng)檢測蛋白表達(dá)：取出 PVDF 膜，用 TBST 洗膜 3 次，每次 10min，，然后將膜室溫封閉 2 h，封閉結(jié)束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 10 m抗：用 5%脫脂奶粉按照抗體說明書要求稀釋一抗，稀釋后例加入，將置于 4℃過夜，第二天取出，置于搖床上復(fù)蘇 2 BST 洗膜 3 次，每次 10 min；二抗：按照一抗的種屬，加入相應(yīng) HRP 標(biāo)記的山羊抗兔 IgG000 稀釋），置于搖床室溫孵育 2 h，TBST 洗膜 3 次，每次 1學(xué)發(fā)光及圖像采集
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R739.41

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 孫海婷;;microRNA作用靶基因的預(yù)測[J];科技創(chuàng)新與應(yīng)用;2013年23期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 王琛;miR-141-3p對前列腺癌LNCaP細(xì)胞生長的影響及其作用機制的探討[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2015年

本文編號：2678227