【摘要】：腦卒中在全球和中國分別是第二和第一致死原因及主要的致殘原因,但是缺乏有效的治療手段。目前,僅3%-5%腦卒中患者接受唯一的腦缺血藥物組織型纖溶酶原激活劑治療,而出血性腦卒中無藥可治,使得腦卒中有效治療策略的研究迫在眉睫。從人多能干細(xì)胞誘導(dǎo)培育獲得的3D結(jié)構(gòu)類腦器官,不僅可以模擬在體人腦發(fā)育進(jìn)程和生理結(jié)構(gòu),而且具有與人腦相似度較高的表觀基因組學(xué)特征,為腦卒中有效治療策略的研究提供了新思路。本課題包含兩部分,從腦卒中移植治療的角度出發(fā),類腦內(nèi)的細(xì)胞種類多樣、種屬來源豐富、細(xì)胞數(shù)量可觀、神經(jīng)分化程度可控,具有一定的組織體積形態(tài)(直徑最大可達(dá)4 mm),為腦卒中后移植修復(fù)、替代受損的神經(jīng)細(xì)胞和腦組織提供了可能性;從腦卒中藥物研發(fā)的角度出發(fā),類腦具有與人腦較為接近的表觀基因組學(xué)、皮層結(jié)構(gòu)和細(xì)胞組成,為人源化腦缺血模型構(gòu)建提供了較好的研究對象,有助于腦卒中潛在神經(jīng)保護(hù)藥的臨床轉(zhuǎn)化。因此,本課題擬開展類腦在腦卒中移植治療及人源化腦缺血模型構(gòu)建中的研究。(一)類腦在腦卒中移植治療中的作用及機(jī)制研究近年來,腦卒中干細(xì)胞移植治療策略被提出,為腦卒中患者提供再生醫(yī)學(xué)治療策略。臨床前證據(jù)顯示,干細(xì)胞移植加強(qiáng)腦卒中后的神經(jīng)再生、血管新生、神經(jīng)重構(gòu),降低腦梗死體積,改善神經(jīng)運動功能。本課題組前期在腦卒中、干細(xì)胞和血管等研究領(lǐng)域具有較好的實驗基礎(chǔ)。因此,本部分課題擬在全世界首次開展類腦在腦卒中移植治療中的作用及機(jī)制研究。1.腦損傷類腦移植供體的比較和選擇通過鑒定類腦在不同培育階段的細(xì)胞組成和細(xì)胞數(shù)量,我們發(fā)現(xiàn)離體培育的55天和85天類腦的細(xì)胞組成分別以神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)元為主,單個類腦的細(xì)胞數(shù)量均超過10~6,可作為神經(jīng)干細(xì)胞或神經(jīng)元組成為主的移植供體。進(jìn)而,在大鼠腦創(chuàng)傷模型中分別移植培育55天類腦和85天類腦,發(fā)現(xiàn)與85天類腦移植相比,55天類腦移植表現(xiàn)出較好的神經(jīng)保護(hù)作用、腦內(nèi)細(xì)胞存活數(shù)量更多,更適合作為腦損傷移植供體,用于腦內(nèi)移植研究。2.腦卒中類腦移植治療時間窗首先,我們制備了在體腦缺血模型,即大鼠大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,發(fā)現(xiàn)在MCAO后6小時、7天、14天腦梗死體積逐漸增加,28天時腦梗死區(qū)的腦組織缺失形成空洞結(jié)構(gòu)。為了探究腦卒中類腦移植治療的有效時間窗,我們分別在MCAO后6小時、24小時或7天,將培育55天類腦移植到大鼠患側(cè)運動皮層區(qū)。通過TTC染色檢測腦梗死體積,神經(jīng)肌肉功能和平衡木表現(xiàn)檢測神經(jīng)運動功能,發(fā)現(xiàn)MCAO后6小時或24小時,類腦移植均顯著降低腦梗死體積,改善神經(jīng)運動功能,為腦卒中類腦移植治療時間窗提供了第一手證據(jù)。2.腦卒中類腦移植治療作用機(jī)制在腦卒中后6小時移植培育55天類腦,我們發(fā)現(xiàn)腦卒中類腦移植治療的作用機(jī)制如下:(1)通過免疫熒光檢測類腦移植后的分化趨勢和神經(jīng)細(xì)胞譜系特征,發(fā)現(xiàn)類腦移植后在患側(cè)皮層移植周圍區(qū)具有多向分化潛能,通過原位分化和細(xì)胞替代模擬在體腦發(fā)育和成熟、支持腦運動皮層特異性重構(gòu)、形成調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)釋放的神經(jīng)元、實現(xiàn)與宿主腦之間的突觸連接。(2)通過免疫熒光檢測類腦移植后在宿主腦內(nèi)的遷移和整合,發(fā)現(xiàn)來自移植類腦的細(xì)胞廣泛分布于腦內(nèi)不同區(qū)域,包括但不局限于同側(cè)和對側(cè)腦皮層、側(cè)腦室,且沿著胼胝體由移植位點遷移到腦內(nèi)深部。(3)通過免疫熒光檢測和比較內(nèi)源性與外源性神經(jīng)再生,發(fā)現(xiàn)類腦移植促進(jìn)神經(jīng)再生,在患側(cè)皮層移植周圍區(qū)以促進(jìn)外源性神經(jīng)再生為主,在海馬和側(cè)腦室區(qū)以促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)再生為主。(4)通過免疫熒光標(biāo)記突觸連接相關(guān)蛋白,發(fā)現(xiàn)類腦移植增強(qiáng)患側(cè)皮層移植周圍區(qū)和海馬區(qū)的突觸重構(gòu);通過HE染色觀察血管密度、免疫熒光標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖,發(fā)現(xiàn)類腦移植增加患側(cè)皮層移植周圍區(qū)的血管密度和血管新生。(5)通過TUNEL染色檢測細(xì)胞凋亡、尼氏染色標(biāo)記神經(jīng)元存活,發(fā)現(xiàn)在患側(cè)皮層移植周圍區(qū),類腦移植減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡,增加神經(jīng)元存活。本部分課題從腦損傷類腦移植供體的比較和選擇、腦卒中類腦移植治療時間窗的確定、腦卒中類腦移植治療作用機(jī)制三方面出發(fā),首次證明腦卒中類腦移植治療的可行性和有效性,并闡明了相關(guān)作用機(jī)制,為類腦移植作為腦卒中潛在有效的生物治療策略提供了第一手臨床前證據(jù)。(二)類腦在人源化腦缺血模型構(gòu)建中的應(yīng)用研究盡管腦卒中神經(jīng)保護(hù)藥已在上千項臨床前研究和上百項臨床試驗中開展,但是大量神經(jīng)保護(hù)劑被證明臨床轉(zhuǎn)化失敗,使得腦卒中藥物研發(fā)迫在眉睫。與腦卒中藥物研究中常用的嚙齒類動物相比,類腦與人腦的表觀基因組學(xué)、皮層結(jié)構(gòu)和細(xì)胞組成接近,種屬差異小,可作為潛在的腦卒中模型制備對象,為構(gòu)建人源化腦缺血模型提供了可能性。課題組前期工作證明了煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(nicotinamide phosphoribosyltransferase,NAMPT)作為腦卒中防治靶標(biāo)。因此,本部分課題擬探究NAMPT潛在激活劑P7C3-A20的抗腦卒中神經(jīng)保護(hù)作用;進(jìn)而,使用類腦制備人源化腦缺血模型,用于包含NAMPT相關(guān)化合物在內(nèi)的腦卒中潛在有效化合物測試,希望推進(jìn)腦卒中神經(jīng)保護(hù)藥的臨床轉(zhuǎn)化。1.首次證明NAMPT潛在激活劑P7C3-A20具有抗腦卒中神經(jīng)保護(hù)作用(1)在離體缺氧缺糖(oxygen-glucose deprivation,OGD)輕中度損傷、重度損傷及再灌注損傷模型中,P7C3-A20減少神經(jīng)元損傷,改善細(xì)胞活力。(2)在大鼠MCAO模型中,P7C3-A20降低腦梗死體積。(3)在正常和腦缺血大鼠中,P7C3-A20提升腦內(nèi)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸水平。2.制備人源化類腦腦缺血模型類腦具有異質(zhì)性,在同一培養(yǎng)批次內(nèi),其形態(tài)和體積不相同。將培育85天類腦根據(jù)直徑大小分組后,與經(jīng)典的離體腦缺血OGD模型相結(jié)合,制備人源化腦缺血模型。(1)人源化腦缺血模型中的類腦挑選標(biāo)準(zhǔn)通過LDH釋放和Caspase 3活性分別檢測和比較不同直徑大小的類腦在相同OGD時間下的細(xì)胞損傷和細(xì)胞凋亡,我們給出了用于制備人源化腦缺血模型的類腦挑選標(biāo)準(zhǔn),即舍棄體積較小的類腦(直徑2 mm),僅選擇體積適中的類腦(直徑≥2 mm),用于人源化腦缺血模型制備,以確保該模型較好的平行性和可重復(fù)性。(2)人源化類腦腦缺血模型的時效關(guān)系將體積適中的類腦根據(jù)直徑大小分組后,給予一系列時間梯度的OGD暴露(1-h、2-h、4-h、6-h、8-h、12-h)。通過LDH釋放和Caspase 3活性分別檢測細(xì)胞損傷和細(xì)胞凋亡,發(fā)現(xiàn)隨著OGD暴露時間的延長,類腦損傷程度逐漸加重,損傷程度和缺血時間之間形成明顯的時效關(guān)系,為藥物測試時選擇特定損傷程度的人源化腦缺血模型提供了實驗參考依據(jù)。3.人源化類腦腦缺血模型中,腦缺血相關(guān)化合物的有效性和適用性(1)人源化類腦腦缺血模型中,腦缺血潛在神經(jīng)保護(hù)藥的有效性研究通過LDH釋放和Caspase 3活性分別檢測細(xì)胞損傷和細(xì)胞凋亡,發(fā)現(xiàn)在人源化類腦腦缺血模型中,NAMPT潛在激活劑P7C3-A20、已投入臨床使用的一線腦缺血藥物(依達(dá)拉奉和丁苯酞)以及腦卒中神經(jīng)保護(hù)小分子化合物ZL006均顯著降低細(xì)胞損傷和細(xì)胞凋亡,即在人源化腦缺血模型中具有一定的敏感性,表現(xiàn)出神經(jīng)保護(hù)作用。(2)人源化類腦腦缺血模型中,腦缺血相關(guān)通路化合物的適用性研究通過LDH釋放和Caspase 3活性分別檢測細(xì)胞損傷和細(xì)胞凋亡,發(fā)現(xiàn)在人源化類腦腦缺血模型中,自噬抑制劑3-MA、廣譜Caspase抑制劑Z-VAD(OMe)-FMK和AMPA/kainate抑制劑CNQX降低細(xì)胞損傷和細(xì)胞凋亡,Bcl-2抑制劑Navitoclax增加細(xì)胞損傷和細(xì)胞凋亡,提示該模型適合但不局限用于靶向自噬、凋亡、AMPA/kainate受體等腦缺血相關(guān)通路化合物研究。本部分課題中,我們首次證明NAMPT潛在激活劑P7C3-A20的抗腦卒中神經(jīng)保護(hù)作用;而后,使用類腦首次制備人源化腦缺血模型,并分析了該模型制備的類腦挑選標(biāo)準(zhǔn)、類腦損傷程度和缺血時間之間的時效關(guān)系,為腦卒中藥物研究提供了一種新的測試模型;進(jìn)一步,我們證明了部分腦卒中潛在神經(jīng)保護(hù)藥和腦缺血相關(guān)通路化合物在人源化腦缺血模型中的有效性和的適用性,為人源化腦缺血模型的應(yīng)用提供了第一手實驗證據(jù),有助于推進(jìn)腦卒中潛在神經(jīng)保護(hù)藥的臨床轉(zhuǎn)化。
【圖文】：

海軍軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文前 言在全球范圍內(nèi)，腦卒中是第二大致死原因及主要致殘原因，具有發(fā)病率高、致死率高、致殘率高、復(fù)發(fā)率高、醫(yī)療費用高等特點，是危害人類健康的嚴(yán)重疾病問題但是缺乏有效的治療手段[1]。目前，獲得 FDA 批準(zhǔn)的腦卒中治療藥物僅有組織型纖溶酶原激活劑（tissue-type plasminogen activator，tPA），用于急性缺血性腦卒中溶栓治療[1-3]，出血性腦卒中尚無藥可用。但是由于 tPA 治療時間窗窄，受禁忌癥限制，并發(fā)癥危險，僅適用于 3%-5%腦卒中患者治療。因此，腦卒中有效治療策略亟需得到解決。

圖 2 人類、黑長尾猴和大鼠的大腦冠狀解剖結(jié)構(gòu)圖人類、黑長尾猴和大鼠的大腦絕對體積不同、腦回結(jié)構(gòu)不同、白質(zhì)比例不同。（圖片來源于 Acta Neuropathol 2017; 133: 245 61）。課 題 組 前 期 一 系 列 工 作 證 明 了 煙 酰 胺 磷 酸 核 糖 轉(zhuǎn) 移 酶 （ nicotinamidephosphoribosyltransferase, NAMPT）作為腦卒中防治新靶標(biāo)。因此，本部分課題計劃首次探究 NAMPT 潛在激活劑 P7C3-A20 在嚙齒類動物腦卒中模型中的神經(jīng)保護(hù)作用；而后，培育人源化類腦器官，首次嘗試制備人源化腦缺血模型，希望可以縮短種屬差異，，用于包含 NAMPT 相關(guān)化合物在內(nèi)的腦卒中潛在有效藥物測試，推進(jìn)腦卒中有效治療藥物的臨床轉(zhuǎn)化。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R743.3


本文編號：2665328