發(fā)布時間：2020-05-13 00:31

【摘要】：背景與目的:自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)是神經(jīng)外科最常見的急癥之一,約占所有腦卒中的5%。SAH具有高致殘率和高死亡率。據(jù)統(tǒng)計,SAH首次破裂的死亡率高達30%左右,幸存者中有8-20%的患者需要長期的護理。近幾年研究發(fā)現(xiàn),SAH后早期腦損傷(early beain injury,EBI)是導致SAH患者預后很差的主要原因。早期腦損傷的機制包括神經(jīng)炎癥,神經(jīng)元凋亡,血腦屏障的破壞和氧化應激等。其中神經(jīng)炎癥和神經(jīng)元凋亡在SAH早期腦損傷的病理生理過程中發(fā)揮了很重要的作用。黑皮質(zhì)素受體-1(Melanocortin receptor-1,MC1 R)是G蛋白偶聯(lián)受體,屬于黑皮質(zhì)素受體家族。MC1R在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中作用非常廣泛,包括調(diào)節(jié)攝食,激素生成及性行為等。此外,MC1R的腦保護作用在近幾年的研究中也得到了廣泛的證實。MC1R不僅能夠減少腦創(chuàng)傷后的炎癥反應,也能夠減少神經(jīng)細胞的凋亡,從而減輕腦損傷。BMS-470539是MC1R高度選擇性激動劑。BMS-470539通過激活MC1R,抑制下游的炎癥和減少細胞凋亡。然而,MC1R和BMS-470539在SAH中的作用尚無相關報道。因此,本研究以大鼠SAH模型為基礎,探索大鼠SAH模型建立后,BMS-470539是否能夠通過激活MC1R,從而減輕EBI,改善大鼠的神經(jīng)功能,減少死亡率。材料與方法學:本實驗共使用403只成年雄性Sprague-Dawey(SD)大鼠。采用血管內(nèi)穿刺法誘導蛛網(wǎng)膜下腔出血。術前48小時經(jīng)側腦室注射PGC-1 α siRNA(small interfering RNA)和對照小干擾RNA(scramble siRNA)。術前一個小時不同組別分別給予MSG-606,MRT-68601,selisistat 等抑制劑,術后 1 小時經(jīng)鼻腔給予 BMS-470539。并比較各組間的SAH出血量評分和神經(jīng)功能評分。此外,還通過rotarod實驗和水迷宮實驗觀察BM S-470539對大鼠長期記憶和認知功能的療效。在機制研究中,通過免疫蛋白印跡法(western blot)檢測穿刺側大腦半球MC1R,p-AMPK,TBK1,NF-κB,SIRT1,PGC-1 α,UCP2等蛋白水平。采用免疫熒光驗證MC1R在小膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元細胞上的表達情況。采用DHE驗證細胞氧化應激的水平。采用末端標記法染色(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling,TUNEL)和 Fluoro-Jade 染色觀察神經(jīng)元凋亡水平。結果:1.蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷中,神經(jīng)功能障礙和腦水腫在24h達到最高峰,同時神經(jīng)炎癥(IL-1β和TNFα)和神經(jīng)元凋亡(caspase-3,Bcl-2和Bax)也在SAH 24h明顯增高。2.MC1R主要表達在神經(jīng)元和小膠質(zhì)細胞上,其表達水平在SAH 24h達到最高峰。3.BMS-470539可以通過激活MC1R明顯減輕腦水腫,改善短期神經(jīng)功能障礙和長期的認知和記憶功能。4.BMS-470539激活MC1R,并進一步通過調(diào)控AMPK/TBK1/NF-κB信號通路,促進小膠質(zhì)細胞向M2轉(zhuǎn)化,從而減輕SAH后炎癥反應,起到腦保護作用。5.MC1R的激活可以通過進一步調(diào)控AMPK/SIRT1/PGC-1α信號通路,降低細胞內(nèi)氧化應激水平,保護線粒體正常功能,從而減少神經(jīng)元凋亡,減輕SAH后早期腦損傷。結論:在SAH模型后,給予BMS-470539可以通過抑制神經(jīng)炎癥,促進小膠質(zhì)細胞向M2轉(zhuǎn)化,并且減少神經(jīng)元的凋亡,從而減輕SAH后早期腦損傷,改善大鼠短期神經(jīng)功能和長期的認知和記憶功能,從而改善SAH的預后。BMS470539可能成為今后腦卒中治療的一種重要的藥物。
【圖文】：

圖１．１早期腦損傷的機制。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．１邋Ｔｈｅ邋ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ邋ｏｆ邋ｅａｒｌｙ邋ｂｒａｉｎ邋ｉｎｊｕｒｙ邋（Ｃａｈｉｌｌ邋ｅｔ邋ａｌ．邋［２３］）．逡逑（２）邋ＭＣ１Ｒ在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用逡逑黑皮質(zhì)素受體（Ｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒ，邋ＭＣＲ）屬于Ｇ蛋白偶聯(lián)受體，一共包括逡逑３逡逑

時禁食但不禁水。逡逑２．２．２實驗分組設計逡逑本實驗由三部分實驗組成（圖２．１），使用大鼠數(shù)量１３４只，包括死亡和排除逡逑（ＳＡＨ邋ｓｃｏｒｅ邋＜７邋分）的大鼠。逡逑實驗一：研究ＭＣ１Ｒ在ＳＡＨ組和假手術組大鼠腦組織中不同細胞類型表達水逡逑平的差異，以及其表達水平隨時間的變化規(guī)律。３６只大鼠隨機分為６組（ｓｈａｍ，逡逑ＳＡＨ后３ｈ，６ｈ，邋１２ｈ，２４ｈ，邋７２ｈ），采用＼＼４１６�。保挢�0１檢測不同時間點＼１（：１尺的表逡逑達水平。此外，再�。粗淮笫螅�，枿機分為兩組：ｓｈａｍ和ＳＡＨ組（ＳＡＨ后２４ｈ）。逡逑采用免疫熒光法檢測ＭＣ１Ｒ在不同腦細胞類型中的表達差異。逡逑實驗二：為了觀察ＢＭＳ－４７０５３９對ＳＡＨ后大鼠的腦保護作用，我們以以往的逡逑文獻為基礎，選取了三種藥物劑量進行進一步的研究。３０只大鼠隨機分為５組：逡逑ｓｈａｍ，邋ＳＡＨ邋＋邋ｖｅｈｉｃｌｅ邋（ｌＯｐｌ邋生理鹽水），ＳＡＨ邋＋邋ＢＭＳ－４７０５３９邋（５０邋｜ｉｇ／ｋｇ，邋１０邋此，ＳＡＨ逡逑＋邋ＢＭＳ－４７０５３９邋（１６０邋呢／ｋｇ，１０邋４），和邋ＳＡＨ邋＋邋ＢＭＳ－４７０５３９邋（５００邋｜ｉｇ／ｋｇ，邋１０邋ｐｉ）。逡逑ＢＭＳ－４７０５３９術后一小時經(jīng)鼻腔給藥。ＳＡＨ邋２４邋ｈ后進行ＳＡＨ出血評分
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R743.35

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