【摘要】：目的NLRP3是NOD樣受體家族的成員,是固有免疫的重要模式識別受體,其識別外源性損傷相關(guān)分子模式和內(nèi)源性損傷相關(guān)分子模式而被激活,與ASC、未成熟的Caspase-1結(jié)合形成NLRP3炎性小體,通過控制IL-1β和IL-18的釋放在病原感染性疾病和自身免疫性疾病中發(fā)揮免疫作用。白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)是參與該過程的關(guān)鍵細(xì)胞因子之一。外周神經(jīng)損傷后最先觸發(fā)固有免疫,但目前NLRP3在外周神經(jīng)損傷后修復(fù)中的作用機制尚不清楚。故本實驗在坐骨神經(jīng)損傷模型的基礎(chǔ)上對NLRP3予以干預(yù),觀察炎性因子的表達量與坐骨神經(jīng)損傷后修復(fù)程度的關(guān)系。旨在探討NLRP3介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在坐骨神經(jīng)損傷后修復(fù)中的作用關(guān)系,為神經(jīng)損傷修復(fù)提供可能的機制。方法1、構(gòu)建坐骨神經(jīng)損傷動物模型。將80只C57BL/6小鼠隨機分為2組,分為假手術(shù)組(20只),手術(shù)組(60只),在相對無菌條件下,建立小鼠坐骨神經(jīng)損傷模型,觀察兩組神經(jīng)組織情況。2、干預(yù)NLRP3信號通路。將第一步中手術(shù)組的60只C57BL/6小鼠隨機分為3組,對照組(20只),MSU組(20只)和MCC950組(20只)。MSU組在損傷坐骨神經(jīng)前半小時,在損傷部位(0.0125 mg/處)施用MSU。MCC950組在坐骨神經(jīng)損傷的第0、1和2天腹膜內(nèi)注射(50 mg/kg)MCC950,之后每2天注射一次。對照組注射同等量的生理鹽水。損傷后4 h、24 h、48 h和72 h,RT-q PCR檢測損傷神經(jīng)IL-1β、NF-κB和Caspase-1基因的表達水平變化。術(shù)后1周、2周和4周,HE染色觀察神經(jīng)損傷的病理變化,LFB染色法觀察小鼠坐骨神經(jīng)髓鞘變化情況,運用免疫組織化學(xué)法檢測GAP-43和p75NTR的蛋白表達情況。術(shù)后1周、2周、3周和4周用SFI即坐骨神經(jīng)功能指數(shù)來評價坐骨神經(jīng)運動功能恢復(fù)情況。結(jié)果成功構(gòu)建坐骨神經(jīng)損傷模型。RT-qPCR結(jié)果顯示,小鼠坐骨神經(jīng)損傷后4 h、24 h、48 h和72 h,與對照組相比,MCC950組小鼠IL-1β、Caspase-1的m RNA表達水平低于對照組(P0.01);三組小鼠IL-1β的m RNA表達水平最高點均在坐骨神經(jīng)損傷后24小時(P0.01),而三組小鼠Caspase-1的m RNA表達水平最高點均在坐骨神經(jīng)損傷后48 h。坐骨神經(jīng)損傷后4 h,MSU組小鼠NF-κB m RNA表達水平較對照組升高,有顯著差異(P0.01),隨后的24 h和48 h檢測發(fā)現(xiàn),與對照組相比MSU組小鼠NF-κB m RNA表達水平偏低;在4 h MCC950組小鼠NF-κB的m RNA表達水平與對照組相比無顯著差異,在24 h、48 h MCC950組小鼠NF-κB m RNA表達水平與對照組相比顯著增高。HE染色結(jié)果表明坐骨神經(jīng)損傷后1、2和4周,與對照組相比,MCC950組小鼠在同一時間炎性細(xì)胞表達量更多,MSU組小鼠在同一時間炎性細(xì)胞表達量較少。免疫組化檢測結(jié)果顯示,與對照組相比,MCC950組小鼠p75NTR、GAP-43蛋白表達量較高,MSU組的p75NTR、GAP-43蛋白表達量較低。LFB結(jié)果顯示,與對照組相比,MSU組小鼠坐骨神經(jīng)組織髓鞘較少,MCC950組髓鞘較多。小鼠的坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(SFI)評分結(jié)果顯示,與對照組小鼠相比,在坐骨神經(jīng)損傷后相同時段,MCC950組小鼠的SFI評分更高,坐骨神經(jīng)功能恢復(fù)更好。結(jié)論成功構(gòu)建小鼠坐骨神經(jīng)損傷模型,闡明能夠通過抑制NLRP3來減少炎性因子的合成分泌或釋放,加快小鼠坐骨神經(jīng)的損傷修復(fù)。研究提示在外周神經(jīng)系統(tǒng)中NLRP3對炎癥因子的影響除了通過NLRP3炎性小體的炎癥小體途徑外,還有其他的途徑。另外NLRP3達到一定劑量時對NF-κB具有負(fù)性調(diào)節(jié)作用,這為進一步探究固有免疫在周圍神經(jīng)損傷后修復(fù)中的作用機制提供了可行的理論依據(jù)。
【圖文】：

圖 1 小鼠足跡測量模式圖Figure 1. The model pattern of mice footprint2.6 統(tǒng)計學(xué)分析采用 Graph Pad Prism 5 統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進行處理分析，±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用 two-wayANOVA 比較各組之間的差異，并利多組之間兩兩比較，，按α=0.05 標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng) P<0.05 時為差異有統(tǒng)計學(xué)

青島大學(xué)碩士學(xué)位論文結(jié) 果1 成功構(gòu)建小鼠坐骨神經(jīng)損傷模型術(shù)后注意小鼠保暖，觀察小鼠呼吸情況，一般術(shù)后 1-2 h 小鼠逐漸蘇醒到術(shù)后小鼠活動量減少，活動時模型組小鼠后退成拖拽狀，注意保持適宜度，濕度，飲水和進食。圖 2A 為坐骨神經(jīng)夾傷前，可見神經(jīng)組織完整，圖坐骨神經(jīng)夾傷后，可見神經(jīng)束被損傷，而神經(jīng)外膜完整。
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R745

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本文編號：2660954