【摘要】：神經(jīng)母細(xì)胞瘤是目前1~5歲低幼兒童人群中常見的惡性度較高的實(shí)體腫瘤。據(jù)統(tǒng)計(jì),由于腫瘤易發(fā)生轉(zhuǎn)移,國內(nèi)患兒的腫瘤切除率達(dá)不到50%,雖然新的化療方案使患兒的生存率略有提高,但無病生存率仍在30%以下。尋找抗神經(jīng)母細(xì)胞瘤新途徑或低副作用的靶向治療藥物成為目前亟待解決的關(guān)鍵問題。谷胱甘肽過氧化物酶(glutaliiione peroxidases,GPXs)是體內(nèi)廣泛存在的一類過氧化物酶的統(tǒng)稱,它可將細(xì)胞內(nèi)過多的活性氧簇(ROS)還原成無毒化合物,并催化H_2O_2分解為水,從而降低過氧化物對細(xì)胞的氧化性損傷。GPX4是此酶系中最重要的亞單位,分布于細(xì)胞內(nèi)各種膜結(jié)構(gòu)上,清除各種脂質(zhì)過氧化物。最近的研究發(fā)現(xiàn),下調(diào)GPX4表達(dá)可以通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生ferroptosis提高腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性。Ferroptosis是新近發(fā)現(xiàn)的鐵依賴的程序性細(xì)胞死亡方式,與凋亡有明顯區(qū)別。小分子化合物erastin是ferroptosis激活劑,通過下調(diào)GPX4導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化物蓄積引起細(xì)胞死亡,并且此過程被ferroptosis抑制劑阻斷時,但不影響化療藥物引起的腫瘤細(xì)胞凋亡。目前多數(shù)化療藥物仍是通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用,但腫瘤細(xì)胞會隨著用藥時間的延長而產(chǎn)生耐藥。Ferroptosis的發(fā)現(xiàn)為抗腫瘤途徑的深入研究提供新的方向。順鉑是抗癌譜廣、作用強(qiáng)的非周期性抗腫瘤藥,與多種化療藥物聯(lián)合應(yīng)用不發(fā)生交叉耐藥,一直作為小兒神經(jīng)母細(xì)胞瘤聯(lián)合化療方案中的一線化療藥物。研究發(fā)現(xiàn),順鉑可誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞和非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞發(fā)生ferroptosis。Ferroportin(Fpn)是細(xì)胞中唯一的鐵輸出蛋白,在鐵的跨膜輸出中起著不可或缺的作用,調(diào)節(jié)鐵的內(nèi)穩(wěn)態(tài)。Fpn表達(dá)的改變可能導(dǎo)致鐵缺乏或鐵超載~([4-6])。細(xì)胞內(nèi)鐵的積累與Fpn的缺乏相關(guān),并且通過增加Feton反應(yīng)產(chǎn)生的脂質(zhì)ROS來促進(jìn)ferroptosis的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn),和GPX4一樣,Fpn也是是腫瘤的獨(dú)立危險因素,與腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者生存率的降低有關(guān)。先前的研究已經(jīng)表明Fpn在癌細(xì)胞中的表達(dá)升高。然而,Fpn在由erastin誘導(dǎo)的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的ferroptosis中的潛在作用還有待探索。下調(diào)Fpn能否與下調(diào)GPX4發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用尚不清楚。小兒神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織中是否存在GPX4的表達(dá),下調(diào)GPX4是否引起人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株死亡,且通過何種死亡方式發(fā)揮作用,對腫瘤細(xì)胞的順鉑敏感性有何影響,以上問題尚無相關(guān)闡述。因此,本研究擬通過體外實(shí)驗(yàn)探討GPX4在人神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織與細(xì)胞株中的表達(dá),研究應(yīng)用RNA干擾技術(shù)沉默GPX4基因后對人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制,同時研究下調(diào)GPX4是否對細(xì)胞的順鉑敏感性產(chǎn)生影響,并通過體外試驗(yàn)研究ferroptosis誘導(dǎo)劑與順鉑聯(lián)合應(yīng)用能否通過下調(diào)GPX4提高抗瘤活性,并進(jìn)一步探討Fpn在調(diào)節(jié)GPX4抑制劑erastin誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞死亡中的作用,以期為小兒神經(jīng)母細(xì)胞瘤的治療提供新的靶向。第一部分GPX4在人神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織與細(xì)胞中的表達(dá)目的:觀察小兒神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織和人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SK-N-SH細(xì)胞株細(xì)胞中GPX4基因與蛋白的表達(dá)情況,探討神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞是否可以成為誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生ferroptosis的靶點(diǎn)。方法:收集我院小兒神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者臨床標(biāo)本42例,用于制作石蠟切片;同時常規(guī)培養(yǎng)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SK-N-SH細(xì)胞株。RT-qPCR法檢測組織與細(xì)胞中GPX4基因的表達(dá)情況;免疫組織化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)和Western blot檢測組織與細(xì)胞中GPX4蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果:1.免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示,在42例神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織標(biāo)本中,有39例標(biāo)本腫瘤組織中腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)充滿棕黃色顆粒即為GPX4陽性表達(dá),陽性表達(dá)率為92.86%,25例標(biāo)本的癌旁組織中也可見GPX4呈微弱陽性表達(dá),陽性表達(dá)率為59.52%。2.免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示,GPX4主要在SK-N-SH細(xì)胞的胞質(zhì)中表達(dá),圖中棕黃色顆粒為陽性表達(dá)。3.Western Blot結(jié)果顯示,42例神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織中均檢測到GPX4蛋白的表達(dá),而癌旁組織中有19例未檢測到GPX4蛋白的表達(dá),23例癌旁組織中呈低表達(dá),相對于內(nèi)參β-actin的表達(dá)量明顯低于腫瘤組織的相對表達(dá)量,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);SK-N-SH細(xì)胞中也檢測到GPX4目的條帶的表達(dá)。4.RT-qPCR結(jié)果顯示,42例神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織中均檢測到GPX4mRNA的表達(dá),而癌旁組織中有13例未檢測到GPX4 mRNA的表達(dá),29例癌旁組織中GPX4 mRNA呈低表達(dá),明顯低于腫瘤組織的相對表達(dá)量,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),SK-N-SH細(xì)胞中也檢測到GPX4 mRNA的表達(dá)。小結(jié):1.GPX4 mRNA與蛋白在人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SK-N-SH細(xì)胞株與小兒神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織中均有表達(dá)。2.GPX4 mRNA與蛋白在小兒神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織中的表達(dá)均明顯高于癌周正常組織。第二部分下調(diào)GPX4對人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制目的:從細(xì)胞的增殖與凋亡變化、細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化水平、細(xì)胞內(nèi)鐵離子含量等形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)水平,探討下調(diào)GPX4基因?qū)ι窠?jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株增殖的影響及其可能機(jī)制。方法:將SK-N-SH細(xì)胞隨機(jī)分為7組,⑴空白對照組:只加轉(zhuǎn)染試劑;⑵陰性對照組:轉(zhuǎn)染試劑和control siRNA-A;⑶無關(guān)對照組:未加siRNA和轉(zhuǎn)染試劑;⑷陽性對照組:轉(zhuǎn)染試劑和β-actin siRNA;⑸實(shí)驗(yàn)組:6.25 nM、12.5 nM和25 nM GPX4 siRNA轉(zhuǎn)染組。分別于干擾24、48和72h后收集細(xì)胞,提取RNA和蛋白。RT-qPCR檢測干擾后各組細(xì)胞中GPX4 mRNA的表達(dá)情況;Western blot檢測轉(zhuǎn)染前后各組細(xì)胞中GPX4蛋白的表達(dá);倒置熒光顯微鏡觀察確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)用GPX4 siRNA的有效轉(zhuǎn)染濃度;MTT法檢測各組細(xì)胞的增殖活性;流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡;TUNEL檢測各組細(xì)胞的凋亡情況;流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞中ROS水平;生化法檢測各組細(xì)胞丙二醛、谷胱甘肽、鐵離子、GPXs活性;透射電鏡觀察細(xì)胞中線粒體結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果:1.GPX4 siRNA干擾效能的評價:⑴熒光實(shí)時定量PCR檢測結(jié)果顯示:無關(guān)對照組、空白對照組、陽性對照組和陰性對照組細(xì)胞中GPX4mRNA的表達(dá)未見明顯改變;實(shí)驗(yàn)A組細(xì)胞用6.25 nM GPX4 siRNA干擾48和72 h后GPX4mRNA的表達(dá)低于無關(guān)對照組、空白對照組、陽性對照組和陰性對照組,但無顯著差異(P0.05);實(shí)驗(yàn)B組用12.5 nM GPX4siRNA干擾24、48和72h后GPX4mRNA的表達(dá)明顯低于無關(guān)對照組、空白對照組、陽性對照組和陰性對照組,實(shí)驗(yàn)C組用25 nM GPX4 siRNA干擾24、48和72h后GPX4mRNA的表達(dá)明顯低于無關(guān)對照組、空白對照組、陽性對照組和陰性對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);實(shí)驗(yàn)B組干擾48 h后GPX4mRNA的表達(dá)明顯低于干擾72 h后,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);實(shí)驗(yàn)C組干擾48 h后GPX4mRNA的表達(dá)明顯低于干擾72 h后,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);實(shí)驗(yàn)B組干擾48 h后GPX4mRNA的表達(dá)高于實(shí)驗(yàn)C組干擾48 h后,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。⑵Western blot檢測結(jié)果顯示:無關(guān)對照組、空白對照組、陽性對照組和陰性對照組細(xì)胞在干擾24、48和72 h后GPX4蛋白的表達(dá)無明顯變化(P0.05);實(shí)驗(yàn)A、B、C組細(xì)胞在干擾48和72 h后GPX4蛋白的表達(dá)均明顯低于無關(guān)對照組、空白對照組、陽性對照組和陰性對照組,干擾72 h后細(xì)胞GPX4蛋白表達(dá)明顯低于干擾48 h后,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);實(shí)驗(yàn)B組干擾48 h后GPX4蛋白表達(dá)明顯低于實(shí)驗(yàn)A組干擾48和72 h后(P0.05);實(shí)驗(yàn)B組干擾72 h后GPX4蛋白表達(dá)低于干擾48后,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);實(shí)驗(yàn)C組干擾72 h后GPX4蛋白表達(dá)明顯低于實(shí)驗(yàn)B組干擾48 h和72 h后(P0.05);實(shí)驗(yàn)C組干擾72 h后GPX4蛋白表達(dá)明顯低于干擾48 h后,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2.MTT檢測結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染試劑對細(xì)胞的存活率無明顯影響;轉(zhuǎn)染GPX4 siRNA下調(diào)GPX4后,細(xì)胞存活率明顯降低,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活率明顯低于無關(guān)對照組和陰性對照組(P0.01)。3.流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染試劑對細(xì)胞凋亡無明顯影響;轉(zhuǎn)染GPX4 siRNA下調(diào)GPX4后,細(xì)胞凋亡率明顯升高,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率明顯高于無關(guān)對照組和陰性對照組(P0.05)。4.TUNEL檢測結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染GPX4 siRNA下調(diào)GPX4后,細(xì)胞凋亡數(shù)明顯增加,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡數(shù)明顯高于無關(guān)對照組和陰性對照組(P0.05)。5.流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染試劑對細(xì)胞內(nèi)ROS水平無明顯影響;轉(zhuǎn)染GPX4 siRNA下調(diào)GPX4后,細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯升高,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯高于無關(guān)對照組和陰性對照組(P0.05)。6.轉(zhuǎn)染試劑對細(xì)胞內(nèi)GSH含量和GPXs活性無明顯影響;轉(zhuǎn)染GPX4siRNA下調(diào)GPX4后,細(xì)胞內(nèi)GSH含量明顯降低,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)GSH含量明顯低于無關(guān)對照組和陰性對照組(P0.05);細(xì)胞內(nèi)GPXs活性明顯降低,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)GPXs活性明顯低于無關(guān)對照組和陰性對照組(P0.05)。7.轉(zhuǎn)染試劑對細(xì)胞內(nèi)MDA含量無明顯影響;轉(zhuǎn)染GPX4 siRNA下調(diào)GPX4后,細(xì)胞內(nèi)MDA含量明顯升高,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)MDA含量明顯高于無關(guān)對照組和陰性對照組(P0.05)。8.轉(zhuǎn)染試劑對細(xì)胞內(nèi)鐵含量無明顯影響;轉(zhuǎn)染GPX4 siRNA下調(diào)GPX4后,細(xì)胞內(nèi)鐵含量無明顯變化,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)鐵含量與無關(guān)對照組和陰性對照組無明顯差異(P0.05)。9.轉(zhuǎn)染試劑對細(xì)胞內(nèi)線粒體形態(tài)無明顯影響;轉(zhuǎn)染GPX4 siRNA下調(diào)GPX4后,細(xì)胞內(nèi)線粒體明顯變小,線粒體膜增厚、電子密度增高。小結(jié):1.下調(diào)GPX4使SK-N-SH細(xì)胞的存活率降低、凋亡率上升。2.下調(diào)GPX4可降低SK-N-SH細(xì)胞內(nèi)的GSH含量、提高細(xì)胞內(nèi)ROS和脂質(zhì)過氧化水平、降低GPXs活性和改變細(xì)胞內(nèi)線粒體的形態(tài)。第三部分下調(diào)GPX4通過ferroptosis提高人神經(jīng)母細(xì)胞瘤對順鉑的敏感性目的:首先觀察下調(diào)GPX4誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞死亡的可能方式;隨后應(yīng)用順鉑干預(yù)細(xì)胞觀察細(xì)胞對順鉑的敏感性的變化;最后將GPX4抑制劑與順鉑聯(lián)合應(yīng)用,觀察協(xié)同抗腫瘤的作用,探討下調(diào)GPX4能否提高SK-N-SH細(xì)胞對順鉑的敏感性。方法:分別應(yīng)用ferroptosis抑制劑、凋亡抑制劑、壞死抑制劑、自噬抑制劑處理SK-N-SH細(xì)胞,48 h后收集細(xì)胞,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。按照處理方式和檢測目的不同將細(xì)胞分別分組:⑴control組、vehicle組、z-vad-fmk組、Fer-1組、Necrostatin-1組、3-MA組;⑵control組、vehicle組、順鉑組、順鉑+siRNA組;⑶control組、vehicle組、順鉑組、Erastin組、順鉑+Erastin組。MTT法檢測各組細(xì)胞的增殖活性;試劑盒法檢測細(xì)胞死亡率;生化法檢測各組細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化水平、谷胱甘肽水平、鐵離子含量和GPXs活性。結(jié)果:1.下調(diào)GPX4誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞死亡的方式:⑴MTT法檢測結(jié)果顯示:與control組相比,vehicle組、z-vad-fmk組、Fer-1組、Necrostatin-1組和3-MA組細(xì)胞增殖率明顯降低(P0.05);與vehicle組相比,Fer-1組細(xì)胞增殖率明顯升高(P0.05),Necrostatin-1組和3-MA組細(xì)胞增殖率無明顯差異(P0.05)。⑵Caspase-3活性檢測結(jié)果顯示:與control組比較,vehicle組、z-vad-fmk組、Fer-1組、Necrostatin-1組和3-MA組細(xì)胞Caspase-3活性明顯升高(P0.05);與vehicle組相比,z-vad-fmk組細(xì)胞Caspase-3活性明顯降低(P0.05),Fer-1組、Necrostatin-1組和3-MA組細(xì)胞Caspase-3活性無明顯差異(P0.05);與z-vad-fmk組相比,Fer-1組細(xì)胞Caspase-3活性明顯降低(P0.05)。⑶細(xì)胞脂質(zhì)過氧化水平檢測結(jié)果顯示:與control組比較,vehicle組、z-vad-fmk組和Fer-1組細(xì)胞脂質(zhì)過氧化水平明顯升高(P0.05);與vehicle組相比,z-vad-fmk組細(xì)胞脂質(zhì)過氧化水平無明顯差異(P0.05),Fer-1組細(xì)胞脂質(zhì)過氧化水平明顯降低(P0.05);與z-vad-fmk組相比,Fer-1組細(xì)胞脂質(zhì)過氧化水平明顯降低(P0.05)。⑷細(xì)胞鐵含量檢測結(jié)果顯示:與control組比較,vehicle組和z-vad-fmk組細(xì)胞鐵含量無明顯差異(P0.05);與vehicle組相比,z-vad-fmk組細(xì)胞鐵含量無明顯差異(P0.05),Fer-1組細(xì)胞鐵含量明顯降低(P0.05);與z-vad-fmk組相比,Fer-1組細(xì)胞鐵含量明顯降低(P0.05)。2.下調(diào)GPX4對SK-N-SH細(xì)胞順鉑敏感性的影響:⑴細(xì)胞死亡率檢測結(jié)果顯示:與control組相比,順鉑組和順鉑+siRNA組細(xì)胞死亡率明顯升高(P0.05);與vehicle組相比,順鉑組和順鉑+siRNA組細(xì)胞死亡率明顯升高(P0.05);與順鉑組相比,順鉑+siRNA組細(xì)胞死亡率明顯升高(P0.05)。⑵細(xì)胞脂質(zhì)過氧化水平檢測結(jié)果顯示:與control組相比,順鉑組和順鉑+siRNA組細(xì)胞脂質(zhì)過氧化水平明顯升高(P0.05);與vehicle組相比,順鉑組和順鉑+siRNA組細(xì)胞脂質(zhì)過氧化水平明顯升高(P0.05);與順鉑組相比,順鉑+siRNA組細(xì)胞脂質(zhì)過氧化水平明顯升高(P0.05)。⑶細(xì)胞GSH含量檢測結(jié)果顯示:與control組相比,順鉑組和順鉑+siRNA組細(xì)胞GSH含量明顯降低(P0.05);與vehicle組相比,順鉑組和順鉑+siRNA組細(xì)胞GSH含量明顯降低(P0.05);與順鉑組相比,順鉑+siRNA組細(xì)胞GSH含量明顯降低(P0.05)。⑷細(xì)胞GPXs活性檢測結(jié)果顯示:與control組相比,順鉑組和順鉑+siRNA組細(xì)胞GPXs活性明顯降低(P0.05);與vehicle組相比,順鉑組和順鉑+siRNA組細(xì)胞GPXs活性明顯降低(P0.05);與順鉑組相比,順鉑+siRNA組細(xì)胞GPXs活性明顯降低(P0.05)。3.Erastin對SK-N-SH細(xì)胞順鉑敏感性的影響:⑴細(xì)胞死亡率檢測結(jié)果顯示:與control組相比,順鉑組、Erastin組和順鉑+Erastin組細(xì)胞死亡率明顯升高(P0.05);與vehicle組相比,順鉑組、Erastin組和順鉑+Erastin組細(xì)胞死亡率明顯升高(P0.05);與順鉑組相比,順鉑+Erastin組細(xì)胞死亡率明顯升高(P0.05);與Erastin組相比,順鉑+Erastin組細(xì)胞死亡率明顯升高(P0.05)。⑵細(xì)胞脂質(zhì)過氧化水平檢測結(jié)果顯示:與control組相比,順鉑組、Erastin組和順鉑+Erastin組細(xì)胞脂質(zhì)過氧化水平明顯升高(P0.05);與vehicle組相比,順鉑組、Erastin組和順鉑+Erastin組細(xì)胞脂質(zhì)過氧化水平明顯升高(P0.05);與順鉑組相比,順鉑+Erastin組細(xì)胞脂質(zhì)過氧化水平明顯升高(P0.05);與Erastin組相比,順鉑+Erastin組細(xì)胞脂質(zhì)過氧化水平明顯升高(P0.05)。⑶細(xì)胞GSH含量檢測結(jié)果顯示:與control組相比,順鉑組、Erastin組和順鉑+Erastin組細(xì)胞GSH含量明顯降低(P0.05);與vehicle組相比,順鉑組、Erastin組和順鉑+Erastin組細(xì)胞GSH含量明顯降低(P0.05);與順鉑組相比,順鉑+Erastin組細(xì)胞GSH含量明顯降低(P0.05);與Erastin組相比,順鉑+Erastin組細(xì)胞GSH含量明顯降低(P0.05)。⑷細(xì)胞GPXs活性檢測結(jié)果顯示:與control組相比,順鉑組、Erastin組和順鉑+Erastin組細(xì)胞GPXs活性明顯降低(P0.05);與vehicle組相比,順鉑組、Erastin組和順鉑+Erastin組細(xì)胞GPXs活性明顯降低(P0.05);與順鉑組相比,順鉑+Erastin組細(xì)胞GPXs活性明顯降低(P0.05);與Erastin組相比,順鉑+Erastin組細(xì)胞GPXs活性明顯降低(P0.05)。小結(jié):1.下調(diào)GPX4可以誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞發(fā)生ferroptosis。2.下調(diào)GPX4可以提高SK-N-SH細(xì)胞對順鉑的敏感性。3.GPX4抑制劑與順鉑聯(lián)合應(yīng)用可提高SK-N-SH細(xì)胞對順鉑的敏感性。第四部分下調(diào)ferroportin可提高人神經(jīng)母細(xì)胞瘤對erastin的敏感性目的:觀察Fpn在調(diào)節(jié)GPX4抑制劑erastin誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞死亡中的作用,探討下調(diào)Fpn能否與下調(diào)GPX4發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用。方法:1.用20μM erastin處理SK-N-SH細(xì)胞6、12、24 h后,實(shí)時熒光定量PCR檢測各時間點(diǎn)細(xì)胞中Fpn mRNA的表達(dá);Western blot檢測各時間點(diǎn)細(xì)胞中Fpn蛋白的表達(dá);用20μM erastin分別與ferrostatin-1、DFO、NAC、Z-VAD-FMK、Necrostatin-1和3-Methyladenine共同處理SK-N-SH細(xì)胞12 h后,用實(shí)時熒光定量PCR檢測各組細(xì)胞中Fpn mRNA的表達(dá)。2.按干預(yù)方法不同,將細(xì)胞分為3組:control組、erastin組、control siRNA組、ferroportin 1 siRNA組,培養(yǎng)24 h后用實(shí)時熒光定量PCR檢測各組細(xì)胞中Fpn mRNA的表達(dá);試劑盒檢測細(xì)胞死亡率、細(xì)胞鐵含量、脂質(zhì)過氧化水平;用ferroportin 1 siRNA+erastin分別與ferrostatin-1、DFO、NAC、Z-VAD-FMK、Necrostatin-1和3-Methyladenine共同處理SK-N-SH細(xì)胞24 h后,檢測細(xì)胞死亡率;按干預(yù)方法將細(xì)胞分為3組:control組、erastin組、erastin+ponasterone組,培養(yǎng)24 h后Western blot檢測各組細(xì)胞中Fpn蛋白的表達(dá)。3.按干預(yù)方法將細(xì)胞分為4組:erastin組、erastin+ponasterone組、erastin+ponasterone+ferroportin 1 siRNA組、Fpn cDNA組,培養(yǎng)24 h后檢測細(xì)胞死亡率、細(xì)胞鐵含量;按干預(yù)方法將細(xì)胞分為3組:control組、erastin組、erastin+Hepcidin組,培養(yǎng)24 h后檢測細(xì)胞死亡率。結(jié)果:1.Erastin對SK-N-SH細(xì)胞中Fpn表達(dá)的影響:用erastin(20μM)處理SH-SY5Y細(xì)胞后,Fpn mRNA在6 h開始下降,12 h后顯著下降(P0.05);Fpn蛋白在12 h后開始下降,24 h后下降明顯(P0.05);此外,erasin以時間依賴的方式降低了Fpn的mRNA和蛋白水平(P0.05);ferrostatin-1、DFO和NAC則上調(diào)Fpn的表達(dá)(P0.05);然而,Fpn的水平不受Z-VAD-FMK、Necrostatin-1和3-Methyladenine的調(diào)節(jié)(P0.05)。2.下調(diào)Fpn對SK-N-SH細(xì)胞erastin敏感性的影響:用ferroportin 1siRNA或?qū)φ誷iRNA轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞,與erastin共孵育12 h,轉(zhuǎn)染ferroportin 1 siRNA可有效降低Fpn mRNA的水平(P0.05);Fpn的下調(diào)使SH-SY5Y細(xì)胞中erastin誘導(dǎo)的生長抑制增強(qiáng)(P0.05);下調(diào)Fpn同樣增加了erasin誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鐵含量和脂質(zhì)過氧化水平(P0.05);此外,與只用erastin處理的細(xì)胞相比,ferrostatin-1、DFO和NAC處理則顯著提高了細(xì)胞的活力(P0.05),而Z-VAD-FMK、Necrostatin-1和3-Methyladenine處理的細(xì)胞沒有影響細(xì)胞活力(P0.05)。3.上調(diào)Fpn對SK-N-SH細(xì)胞erastin敏感性的影響:用ponasterone(10μM)孵育24 h后,Fpn的蛋白水平顯著升高(P0.05);Fpn誘導(dǎo)劑ponasterone,降低了erastin誘導(dǎo)的細(xì)胞生長抑制作用和細(xì)胞內(nèi)鐵含量(P0.05);相反,FPN siRNA下調(diào)Fpn逆轉(zhuǎn)了ponasterone的作用(P0.05);同時,通過轉(zhuǎn)染Fpn cDNA上調(diào)Fpn后也顯著降低erastin誘導(dǎo)的細(xì)胞生長抑制和鐵含量(P0.05);Hepcidin促進(jìn)了erastin誘導(dǎo)的ferroptosis(P0.05)。小結(jié):1.下調(diào)Fpn可以誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞發(fā)生ferroptosis。2.下調(diào)Fpn可以提高SK-N-SH細(xì)胞對erastin的敏感性。結(jié)論:1.人神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織與細(xì)胞中均有GPX4的表達(dá)2.下調(diào)GPX4可誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞發(fā)生凋亡和ferroptosis。3.下調(diào)GPX4通過提高SK-N-SH細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化水平和降低GSH含量誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生ferroptosis。4.下調(diào)GPX4可以提高SK-N-SH細(xì)胞對順鉑的敏感性。5.GPX4抑制劑與順鉑聯(lián)合應(yīng)用可提高SK-N-SH細(xì)胞對順鉑的敏感性。6.下調(diào)Fpn可以誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞發(fā)生ferroptosis。7.下調(diào)Fpn可以提高SK-N-SH細(xì)胞對erastin的敏感性。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R739.4

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本文編號：2650148