發(fā)布時(shí)間：2017-03-23 13:10

  本文關(guān)鍵詞：RNF213基因?qū)熿F病相關(guān)致病因子作用的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:探討SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rat bone marrow mesenchymal stem cells,rBMSCs)中RNF213基因?qū)EGF、bFGF、TGF-β1、MMP-9基因表達(dá)的影響,明確RNF213基因量變?cè)跓熿F病發(fā)病過(guò)程中的作用。內(nèi)容:收集濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科和神經(jīng)內(nèi)科2014年9月至2015年4月間入院的煙霧病患者以及體檢中心健康人的血清,用Elisa方法分別檢測(cè)煙霧病患者組以及健康人對(duì)照組血清中VEGF、bFGF、TGF-β1、MMP-9的含量,比較兩組間相關(guān)因子含量的差異。分離、培養(yǎng)SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞以達(dá)到純化的目的,應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)和成骨、成脂誘導(dǎo)分化進(jìn)行鑒定。分別將RNF213-shRNA和Negative-shRNA慢病毒重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染第3代rBMSCs,通過(guò)RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)RNF213-shRNA對(duì)VEGF、bFGF、TGF-β1、MMP-9 mRNA表達(dá)的影響。方法:通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(Elisa)方法檢測(cè)煙霧病組和健康人對(duì)照組血清中VEGF、bFGF、TGF-β1、MMP-9的含量,用SPSS19.0分析兩者血清中VEGF、bFGF、TGF-β1、MMP-9表達(dá)量的差異。應(yīng)用全骨髓貼壁法分離、培養(yǎng)rBMSCs進(jìn)行純化,并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和成骨、成脂方向誘導(dǎo)分化對(duì)純化后的第3代rBMSCs進(jìn)行鑒定。選用第3代rBMSCs作為細(xì)胞實(shí)驗(yàn)對(duì)象,分別將RNF213-shRNA和Negative-shRNA慢病毒重組質(zhì)粒對(duì)第3代細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染,將實(shí)驗(yàn)分為A組(轉(zhuǎn)染RNF213-shRNA慢病毒的rBMSCs組)、B組(轉(zhuǎn)染Negative-shRNA慢病毒的rBMSCs組)、C組(未轉(zhuǎn)染的rBMSCs組),應(yīng)用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)慢病毒的轉(zhuǎn)染效率以及三組rBMSCs轉(zhuǎn)染慢病毒7天和15天時(shí)VEGF、bFGF、TGF-β1、MMP-9 mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果:1.與健康人對(duì)照組相比,煙霧病組血清中VEGF、bFGF、TGF-β1、MMP-9的表達(dá)水平均明顯升高,兩組間差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2.分離純化的第3代rBMSCs細(xì)胞表面高表達(dá)CD90(95.15%)和CD44(99.23%),低表達(dá)CD45(0.74%)。成骨誘導(dǎo)21天后,用茜素紅進(jìn)行染色,可見(jiàn)明顯的紅色致密鈣化結(jié)節(jié);成脂誘導(dǎo)14天后,用油紅O進(jìn)行染色,可見(jiàn)胞內(nèi)大量紅色脂滴形成。3.RNF213-shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染效率鑒定結(jié)果顯示:相對(duì)于C組(未轉(zhuǎn)染rBMSCs組),A組、B組RNF213 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.028±0.002、0.976±0.021,兩組之間相對(duì)表達(dá)量的差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。4.轉(zhuǎn)染后第7天RT-qPCR結(jié)果顯示:相對(duì)于C組,A組、B組VEGF mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.915±0.112、0.949±0.012,兩組之間相對(duì)表達(dá)量的差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);A組、B組bFGF mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.964±0.023、0.958±0.035,兩組之間相對(duì)表達(dá)量的差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);A組、B組TGF-β1mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為3.269±0.968、0.996±0.005,兩組之間相對(duì)表達(dá)量的差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);A組、B組MMP-9 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為3.147±0.320、0.946±0.052,兩組之間相對(duì)表達(dá)量的差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。5.轉(zhuǎn)染后第14天RT-qPCR結(jié)果顯示:相對(duì)于C組,A組、B組VEGF mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.973±0.019、0.966±0.026,兩組之間相對(duì)表達(dá)量的差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);A組、B組bFGF mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為1.582±0.272、0.966±0.039,兩組之間相對(duì)表達(dá)量的差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);A組、B組TGF-β1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為2.370±0.068、0.974±0.019,兩組之間相對(duì)表達(dá)量的差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);A組、B組MMP-9 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為2.741±0.374、0.976±0.044,兩組之間相對(duì)表達(dá)量的差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。結(jié)論:1.相對(duì)于健康人對(duì)照組,煙霧病組血清中VEGF、bFGF、TGF-β1、MMP-9的表達(dá)水平均明顯升高,說(shuō)明VEGF、bFGF、TGF-β1、MMP-9在煙霧病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能發(fā)揮了重要作用。2.利用全骨髓貼壁法可成功分離SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,第3代細(xì)胞可作為后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)良好的種子細(xì)胞。3.RNF213-shRNA可有效抑制rBMSCs中RNF213基因的表達(dá),RNF213基因的低表達(dá)可誘導(dǎo)bFGF、TGF-β1、MMP-9基因的高表達(dá)。4.RNF213基因可能通過(guò)某種基因通路影響bFGF、TGF-β1、MMP-9基因的表達(dá),從而使煙霧病患者體內(nèi)bFGF、TGF-β1、MMP-9表達(dá)異常,說(shuō)明RNF213基因量變?cè)跓熿F病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能發(fā)揮了重要作用。
【關(guān)鍵詞】：煙霧病 RNF213 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 堿性成纖維生長(zhǎng)因子 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β1 基質(zhì)金屬蛋白酶 9
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R743
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 縮略語(yǔ)/符號(hào)說(shuō)明11-12
• 前言12-17
• 研究現(xiàn)狀、成果12-15
• 研究目的、方法15-17
• 一、煙霧病患者血清中相關(guān)因子的表達(dá)17-26
• 1.1 對(duì)象和方法17-20
• 1.1.1 研究對(duì)象17-18
• 1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和耗材18
• 1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器18-19
• 1.1.4 研究方法19
• 1.1.5 數(shù)據(jù)處理19-20
• 1.2 結(jié)果20-23
• 1.3 討論23-25
• 1.4 小結(jié)25-26
• 二、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒定26-37
• 2.1 對(duì)象和方法26-30
• 2.1.1 研究對(duì)象26
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和耗材26-27
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器27
• 2.1.4 研究方法27-30
• 2.1.5 數(shù)據(jù)處理30
• 2.2 結(jié)果30-34
• 2.2.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)特征30-31
• 2.2.2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞傳代細(xì)胞成活率測(cè)定31
• 2.2.3 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞傳代細(xì)胞貼壁率測(cè)定31
• 2.2.4 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定31
• 2.2.5 流式細(xì)胞術(shù)鑒定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞31
• 2.2.6 成骨誘導(dǎo)分化鑒定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞31-32
• 2.2.7 成脂誘導(dǎo)分化鑒定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞32-34
• 2.3 討論34-36
• 2.4 小結(jié)36-37
• 三、RNF213-shRNA轉(zhuǎn)染與相關(guān)因子mRNA表達(dá)檢測(cè)37-49
• 3.1 對(duì)象和方法37-40
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑37-38
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器38
• 3.1.3 實(shí)驗(yàn)分組38
• 3.1.4 轉(zhuǎn)染方法38
• 3.1.5 RT-qPCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率38-40
• 3.1.6 RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)因子mRNA表達(dá)的變化40
• 3.1.7 數(shù)據(jù)處理40
• 3.2 結(jié)果40-44
• 3.2.1 RNF213-shRNA對(duì)RNF213 mRNA表達(dá)的影響40-41
• 3.2.2 RNF213-shRNA對(duì)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)因子mRNA表達(dá)的影響41-44
• 3.3 討論44-48
• 3.3.1 RNA干擾技術(shù)與慢病毒載體44-45
• 3.3.2 RNF213基因與煙霧病45-48
• 3.4 小結(jié)48-49
• 結(jié)論49-51
• 參考文獻(xiàn)51-56
• 發(fā)表論文和參加科研情況說(shuō)明56-57
• 綜述 煙霧病病因及發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展57-65
• 綜述參考文獻(xiàn)62-65
• 致謝65-66
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷66

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