本文關鍵詞：AQP4在星形膠質細胞低糖性水腫中的作用及機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:探討水通道蛋白4(aquaporin 4,AQP4)在星形膠質細胞低血糖性水腫中所起的作用及其相關作用機制。方法:(1)在嚴重低血糖條件下(0.2m M葡萄糖)檢測原代星形膠質細胞和星形膠質細胞系CTX-TNA2細胞體積的變化情況;(2)檢測原代星形膠質細胞和CTX-TNA2星形膠質細胞中水通道蛋白4的表達情況;(3)構建帶EGFP標簽的野生型AQP4并轉染至CTX-TNA2細胞中,建立表達AQP4蛋白的細胞模型,同時予以低血糖(0.2m M葡萄糖)干預,24小時后觀察表達AQP4細胞體積的變化情況;(4)使用AQP4 Si RNA抑制原代星形膠質細胞AQP4的表達,予以上述處理后比較低血糖時AQP4抑制組和對照組細胞體積的變化情況,進一步驗證實驗結果;(5)構建突變型p EGFP-C2-AQP4-M23質粒:S111A和S180A,檢測這兩種突變型蛋白在低血糖性細胞水腫中的作用效果。所收集的實驗數(shù)據(jù)使用SPSS Statistics 16.0對結果進行統(tǒng)計學分析。結果:(1)在長時間嚴重低血糖條件下原代星形膠質細胞出現(xiàn)細胞水腫,而CTX TNA細胞無此現(xiàn)象;(2)原代星形膠質細胞表達水通道蛋白4而CTX-TNA2細胞系不表達;(3)CTX-TNA2細胞轉染AQP4-EGFP質粒后24小時可見綠色熒光蛋白表達,并可被特異性的AQP4抗體所識別,成功構建了AQP4示蹤系統(tǒng);同時,在嚴重低血糖條件下,過表達AQP4的CTX-TNA2細胞與野生型CTX-TNA2細胞相比細胞體積明顯變大;(4)抑制原代星形膠質細胞AQP4蛋白的表達后低血糖條件下細胞水腫的現(xiàn)象消失;(5)低血糖處理24h后,表達野生型AQP4和S180A突變AQP4的CTX-TNA2細胞體積明顯大于對照組,而表達S111A型AQP4蛋白的細胞體積與對照組無明顯差別。結論:低血糖性星形膠質細胞水腫的形成過程中需要AQP4的參與,在這一過程中AQP4蛋白的第111位絲氨酸活化起到了關鍵作用。
【關鍵詞】：水通道蛋白4 綠色熒光蛋白 低血糖 腦水腫
【學位授予單位】：上海交通大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R587.2;R747.9
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-7
• 英文縮略語7-13
• 1 前言13-20
• 1.1 低血糖性腦損傷13-17
• 1.1.1 認知障礙15
• 1.1.2 癲癇15-16
• 1.1.3 昏迷與腦水腫16-17
• 1.2 星形膠質細胞在腦水腫形成中的作用17-18
• 1.3 研究內(nèi)容及意義18-20
• 2 材料與方法20-47
• 2.1 實驗材料20-23
• 2.1.1 實驗動物與細胞系20
• 2.1.2 載體質粒20-21
• 2.1.3 主要實驗試劑21-22
• 2.1.4 主要實驗器械和儀器22-23
• 2.2 主要試劑的配置23-25
• 2.3 采用主要軟件25-26
• 2.4 實驗方法26-47
• 2.4.1 分離及培養(yǎng)原代星形膠質細胞26
• 2.4.2 CTX TNA2細胞的培養(yǎng)與傳代26-27
• 2.4.3 低血糖時AST和CTX TNA2星形膠質細胞體積的檢測27-28
• 2.4.4 AQP4在AST和CTX TNA2星形膠質細胞中的表達28-30
• 2.4.5 提取大鼠腦部組織總RNA30-31
• 2.4.6 AQP4目的基因的擴增31-35
• 2.4.6.1 逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR反應）過程(參考ReverTra Ace qPCR RT Kit說明書)31
• 2.4.6.2 巢式PCR反應過程31-34
• 2.4.6.3 PCR反應產(chǎn)物的提取與純化34-35
• 2.4.7 pEGFP-C2-AQP4-M23重組質粒的構建35-36
• 2.4.8 轉化DH5α 感受態(tài)細胞36-37
• 2.4.9 單克隆細菌菌落的挑取與培養(yǎng)37
• 2.4.10 質粒的提取與純化37-38
• 2.4.11 pEGFP-C2-AQP4-M23重組質粒的鑒定38-40
• 2.4.11.1 酶切鑒定38-39
• 2.4.11.2 pEGFP-C2-AQP4-M23重組質粒轉染 293T細胞，檢測AQP4蛋白的表達情況39-40
• 2.4.12 低血糖時水通道蛋白4對星形膠質細胞體積的影響40-41
• 2.4.13 抑制水通道蛋白4對低血糖性星形膠質細胞水腫的影響41-42
• 2.4.13.1 原代星形膠質細胞的準備41
• 2.4.13.2 轉染AQP4 siRNA抑制原代星形膠質細胞中AQP4的表達41-42
• 2.4.13.3 實驗分組和低血糖條件處理42
• 2.4.14 AQP4介導低血糖性星形膠質細胞水腫的作用位點的研究42-45
• 2.4.14.1 構建AQP4 M23突變體42-44
• 2.4.14.2 轉化DH5α 感受態(tài)細胞44
• 2.4.14.3 單克隆細菌菌落的挑取與培養(yǎng)44-45
• 2.4.14.4 S111A-AQP4 M23和S180A-AQP4 M23突變質粒的提取與純化45
• 2.4.14.5 S111A-AQP4 M23和S180A-AQP4 M23突變質粒的測序鑒定45
• 2.4.15 AQP4蛋白第111位和第180位絲氨酸磷酸化對低血糖時星形膠質細胞水腫形成的影響45-47
• 3 實驗結果47-68
• 3.1 低血糖時原代星形膠質細胞（AST）體積增大而星形膠質細胞系（CTX TNA2）體積未發(fā)生變化47-49
• 3.1.1 原代星形膠質細胞低血糖時的細胞體積變化48-49
• 3.1.1.1 細胞形態(tài)變化48
• 3.1.1.2 細胞體積的統(tǒng)計學結果48-49
• 3.1.2 星形膠質細胞系（CTX TNA2）低血糖時的細胞體積變化49
• 3.1.2.1 細胞形態(tài)變化49
• 3.1.2.2 細胞體積的統(tǒng)計學結果49
• 3.2 水通道蛋白4在AST細胞中有明顯表達，，而在CTX TNA2星形膠質細胞中沒有表達49-51
• 3.2.1 細胞免疫熒光結果50
• 3.2.2 Western Blot實驗結果50-51
• 3.3 大鼠腦部組織總RNA的濃度與純度檢測51
• 3.4 AQP4目的片段擴增產(chǎn)物的獲得51-52
• 3.5 pEGFP-C2-AQP4-M23重組質粒的鑒定結果初步表明質粒構建成功52-56
• 3.5.1 酶切鑒定結果52-54
• 3.5.2 pEGFP-C2-AQP4-M23重組質粒測序結果顯示表達質粒構建成功54-55
• 3.5.3 熒光顯微鏡檢測轉染效果顯示表達質粒能夠成功表達綠熒光蛋白55-56
• 3.5.4 Western Blot結果顯示重組質�？梢猿晒Ρ磉_AQP4蛋白56
• 3.6 重組質粒pEGFP-C2-AQP4-M23在CTX TNA2細胞中的表達與定位56-58
• 3.7 轉染AQP4的CTX TNA2細胞在低血糖誘導條件下發(fā)生細胞水腫58-59
• 3.7.1 LSCM掃描圖像結果58-59
• 3.7.2 細胞體積的統(tǒng)計學分析59
• 3.8 抑制原代星形膠質細胞AQP4的表達后低血糖引起星形膠質細胞水腫的現(xiàn)象消失59-64
• 3.8.1 時間對AQP4 SiRNA抑制AQP4蛋白表達效果的影響59-60
• 3.8.2 抑制原代星形膠質細胞AQP4的表達后低血糖時星形膠質細胞的體積變化60-64
• 3.8.2.1 低血糖條件下轉染AQP4 SiRNA的原代星形膠質細胞表達AQP4蛋白情況60-61
• 3.8.2.2 低血糖條件下轉染AQP4 SiRNA的原代星形膠質細胞形態(tài)變化61-62
• 3.8.2.3 抑制原代星形膠質細胞AQP4蛋白的表達后，低血糖條件下細胞體積無明顯變化62-64
• 3.9 AQP4介導低血糖性星形膠質細胞水腫的作用位點為111位絲氨酸64-68
• 3.9.1 S111A AQP4 M23和S180A AQP4 M23突變體的構建64-65
• 3.9.2 S111A AQP4 M23和S180A AQP4 M23突變體對低血糖性星形膠質細胞水腫形成的影響65-68
• 3.9.2.1 S111A AQP4 M23和S180A AQP4 M23突變體對低血糖性星形膠質細胞形態(tài)變化的影響65-66
• 3.9.2.2 各組細胞體積的統(tǒng)計學分析66-68
• 4 討論68-73
• 5 結論與展望73-74
• 6 參考文獻74-78
• 致謝78-79
• 學術論文和科研成果目錄79
• 學術論文79
• 專利79

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