【摘要】：帕金森病(Parkinson's disease, PD)是多發(fā)于中老年的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,主要病理改變是中腦黑質(zhì)(substantia nigra, SN)致密帶多巴胺(dopamine, DA)能神經(jīng)元退行性變,從而導(dǎo)致紋狀體(striatum, Str)釋放的DA減少所致。雖然遺傳、環(huán)境、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、蛋白質(zhì)異常聚集等因素均參與PD的發(fā)病,但其確切病因尚不清楚。目前PD病人DA能神經(jīng)元的保護(hù)性治療途徑主要包括鐵離子去除途徑、單胺氧化酶-B抑制途徑、神經(jīng)營養(yǎng)因子補(bǔ)充、抗氧化劑的應(yīng)用、神經(jīng)移植、神經(jīng)節(jié)苷脂途徑等,但尚無行之有效的治療辦法可以阻止或者延緩DA能神經(jīng)元的退行性變。因此,深入探討PD的發(fā)病機(jī)制,針對PD病因篩選研發(fā)更有效的天然或人工合成藥物成為PD研究的關(guān)鍵問題之一 Nesfatin-1是2006年發(fā)現(xiàn)的一種由82個氨基酸組成的腦腸肽,由胃底的X/A樣細(xì)胞分泌,其主要功能是抑制攝食和參與能量代謝,新近研究發(fā)現(xiàn)它也可以參與調(diào)節(jié)生殖、應(yīng)激反應(yīng)、認(rèn)知等過程,并與抑郁和焦慮、癲癇的發(fā)病有關(guān)。目前有研究發(fā)現(xiàn)nesfatin-1在大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血和腦外傷中通過抗凋亡機(jī)制發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。由于其與腦腸肽ghrelin都由胃底的X/A樣細(xì)胞分泌,本課題組的前期研究工作已證實ghrelin對DA能神經(jīng)元具有神經(jīng)保護(hù)作用,那么,nesfatin-1對DA能神經(jīng)元是否具有同樣的保護(hù)作用?為了探討這一問題,在1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin, MPTP)制備的亞急性PD小鼠模型上,通過高效液相色譜(high performance liquid chromatography, HPLC)檢測了DA及其代謝產(chǎn)物的含量,免疫組織化學(xué)和免疫熒光技術(shù)觀察了DA能神經(jīng)元及其神經(jīng)末梢的改變,蛋白免疫印跡法檢測了SN區(qū)酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase, TH)含量的改變,觀察了nesfatin-1對DA能神經(jīng)元的保護(hù)作用。并進(jìn)一步在體外培養(yǎng)的DA能細(xì)胞系——MES23.5細(xì)胞上,應(yīng)用1-甲基-4-苯基吡啶陽離子(1-methyl-4-phenylpyridillium ion, MPP+)制備PD的細(xì)胞模型,通過3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-yl)-3,5-di-phenytetrazoliumromide, MTT)法檢測細(xì)胞存活率,流式細(xì)胞術(shù)檢測線粒體跨膜電位差(mitochondrial transmembrane potential,△ΨM)和caspase-3活性的變化,werstern blot法檢測細(xì)胞色素C (cytochrome C, Cyt C)含量及細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK1/2)磷酸化的變化,細(xì)胞免疫化學(xué)檢測細(xì)胞核形態(tài)學(xué)改變,來深入探討nesfatin-1神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制。結(jié)果如下： 1.在MPTP制備的亞急性PD模型小鼠中,Str內(nèi)DA及其代謝產(chǎn)物二羥基苯乙酸(dihydroxyphenylacetic acid, DOPAC)和高香草酸(homovanillic acid, HVA)的含量均降低,分別降低96.61%、85.51%和97.2%(P0.05)。100ng/μL和200ng/μL nesfatin-1預(yù)處理后,可拮抗由MPTP導(dǎo)致的DA、DOPAC和HVA含量的下降；400ng/μL nesfatin-1預(yù)處理后,可拮抗MPTP導(dǎo)致的DA和HVA含量的下降(P0.05)。 2.在MPTP制備的亞急性PD模型小鼠中,SN區(qū)內(nèi)TH免疫陽性細(xì)胞數(shù)目減少30%,TH蛋白表達(dá)下降37%,與對照組相比,差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),同時Str區(qū)TH免疫陽性神經(jīng)纖維末梢減少。100ng/μL,200ng/μL,400ng/μL nesfatin-1預(yù)處理可拮抗MPTP造成的DA能神經(jīng)元損傷,TH免疫陽性神經(jīng)元數(shù)目分別恢復(fù)至正常對照組的100%,82%,80%(P0.05),TH蛋白表達(dá)分別恢復(fù)至正常對照組的100%,98%,95%(P0.05),Str區(qū)TH免疫陽性神經(jīng)纖維末梢增多。 3. MPP+(300μmol/L)孵育MES23.5細(xì)胞24小時后,細(xì)胞存活率降低至對照組的74.82%,與對照組相比,差別有高度統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。不同濃度的nesfatin-1(10-7～10-13mol/L)預(yù)孵育后,可拮抗MPP+引起的細(xì)胞存活率的降低,分別為對照組的101.54%、114.39%、120.78%、110.45%、107.15%、107.78%和101.68%。10^9mol/L nesfatin-1的作用最明顯。 4. MPP+(300μmol/L)孵育MES23.5細(xì)胞24小時后,細(xì)胞ΔΨM出現(xiàn)降低(P0.05),而nesfatin-1(10-8和10-9mol/L)預(yù)處理后,可拮抗MPP+造成的ΔΨM的下降(P0.05),10-9mol/L nesfatin-1的作用最明顯。 5. MPP+(300μmol/L)孵育MES23.5細(xì)胞24小時后,細(xì)胞線粒體內(nèi)Cyt C的含量降低,而胞漿中Cyt C含量升高(P0.05)。10-9mol/L nesfatin-1預(yù)處理后,可拮抗MPP+造成的Cyt C從線粒體至細(xì)胞漿的釋放(P0.05)。 6. MPP+(300μmol/L)孵育MES23.5細(xì)胞24小時后,能夠?qū)е碌蛲鲂?yīng)酶caspase-3的激活,caspase-3的活性為對照組的174.78%(P0.05).10-9mol/L nesfatin-1預(yù)處理后,可以拮抗MPP+誘發(fā)的caspase-3的激活(P0.05)。 7. MPP+(300μmol/L)孵育MES23.5細(xì)胞24小時后,細(xì)胞出現(xiàn)核的固縮、深染、破裂等凋亡現(xiàn)象,10-9mol/L nesfatin-1預(yù)孵育后,上述現(xiàn)象消失。 8.10-9mol/L nesfatin-1預(yù)孵育MES23.5細(xì)胞能夠誘導(dǎo)ERK1/2蛋白磷酸化,30min達(dá)到高峰。盡管ERK1/2/MAPK磷酸化的阻滯劑PD98059預(yù)孵育30min,能夠拮抗nesfatin-1誘導(dǎo)的ERKl/2磷酸化,但不能改變nesfatin-1拮抗MPP+誘導(dǎo)的ΔΨM下降和caspase-3激活的作用。 上述結(jié)果表明,nesfatin-1對MPTP和MPP+所致的DA能神經(jīng)元的損傷均有保護(hù)作用,其機(jī)制可能是通過保護(hù)線粒體功能,抑制Cyt C的釋放,進(jìn)一步抑制caspase-3的激活而發(fā)揮,而這種保護(hù)作用與ERK1/2/MAPK信號通路無關(guān)。Nesfaitn-1可以通過抗凋亡功能而發(fā)揮對DA能神經(jīng)元的保護(hù)作用,為PD的預(yù)防和治療提供了新的策略,也為探討nesfatin-1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的生理作用提供了新的依據(jù)。
【圖文】：

結(jié)果n ,、口 ‘a(chǎn) ‘ ^ * b ? Ci _ f、耀i2 Nesfatio-1措抗MPTP小鼠SN區(qū)TH陽性細(xì)胞數(shù)目下降、TH蛋白表達(dá)降低和Str區(qū)TH免疫陽性經(jīng)纖維末梢的減少ig.2 Nesfatin-l antagonized MPTP-lnduced reduction in the number of TH-positive neurons andTH levels in the SN, as well as TH immunoreactive fibers in the striatumriginal figures showed TH-positive neurons in different groups. B Data showed the numbers -positive neurons in different groups ( *P<0.05 vs control; #P<0.05 vs MPTP-treated group). ginal figures and statistic data showed TH levels in the SN in different groups determined by Westet (n=6 ’ *P < 0.05 vs control; < 0.05 vs MPTP-treated group). D Original figures showed Tunoreactive fibers in the striatum in different groups, a control group; b MPTP group;TP+Nesfatin-1 (100 ng/|iL); d MPTP+Nesfatin-1 (200 ng/pL); e MPTP+Nesfatin-1 (400 ng/|iL).Nesfatin-l能夠括抗MPP+誘導(dǎo)的MES23.5細(xì)胞的損傷上述動物實驗證明小鼠側(cè)腦室注射nesfatin-l可有效括抗MPTP引起的中腦炓質(zhì)D經(jīng)元損傷。為了深入探討其神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制，在體外培養(yǎng)的DA能細(xì)胞MES23.5細(xì)胞上，觀察了nesfatin-l對神經(jīng)毒素MPP+引起的DA能細(xì)胞損傷的保護(hù)。如圖3所示，MPPiS育MES23.5細(xì)胞24小時后，細(xì)胞存活率降低至對照組的74.82%，照組相比，差別有高度統(tǒng)計學(xué)意義（尸<0.05)。不同濃度的nesfatin-ll/L)預(yù)孵育后，，可詰抗MPP+引起的細(xì)胞存活率的降低，分別為對照組的101.54%.39%、120.78%、110.45%、107.15%、107.78%、101.68%。10.9 mol/L nesfatin-l 的21

結(jié)果 A I— M2 =|-—, M2 M2I M1 M1 M1J2 10° 10^ 102 IQS 10? 10° 10^ 10^ 10? 10* 10° 10^ 10^ 1(^ 10*c FlH-i FLH~1§ OmtrcA MPP^ MPT+IO^ mol/L ftefatin-l11~ M2 |[—, M2：M1 f M110? 10^ 103 10? 10? 10^ ICH 10^ 10?aH-1MPPHIO^ mol/L Nesfatin-1 MPP^+ia^? moi/L Nesfatin-lMPPNfiesfatin^l (mol/L)B Control MPP* 1 滬 jQ-g 10加PlI 1m IJZ -k。 -2OL圖4 Nesfatin-1拮抗MPP+誘導(dǎo)的AH^M的下降Fig.4 Nesfatin-1 antagonized MPP+-induced reduction in ATM.Changes were found in mitochondrial transmembrane potential (A4^m) with nesfatin-1 pretreatment. MPP+(300 |imol/L) treatment resulted in a A^m decrease assessed by flow cytometry after 24 h exposure.Pre-incubation with nesfatin-1 (10-8 and 10'^ mol/L) abolished these changes. A Fluorometric assays ofA中m. B Statistical analysis. Data are presented as percentage of control (set at 100%). *尸<0.05 comparedwith control, UP < 0.05 compared with MPP+ group. FLl-H, the pulse height of channel 1 (488 nmexcitation and 525 nm emission); Ml , the gate of damaged cells; M2, the gate of normal cells.5. Nesfatin-1能夠拮抗MPP+誘導(dǎo)的CytC的釋放細(xì)胞線粒體的損傷，能夠改變線粒體膜的通透性，使位于線粒體膜內(nèi)側(cè)的CytC釋放至胞團(tuán)內(nèi)。為了進(jìn)一步探討nesfatin-1對細(xì)胞的保護(hù)作用是否與抑制MPP+引起的Cyt C23
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R742.5

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 ;Curcumin protects nigral dopaminergic neurons by iron-chelation in the 6-hydroxydopamine rat model of Parkinson's disease[J];Neuroscience Bulletin;2012年03期

2 Yutaka Oomura;;Expression of nesfatin-1/NUCB2 in rodent digestive system[J];World Journal of Gastroenterology;2010年14期

本文編號：2583715