【摘要】：神經(jīng)病理性疼痛(Neuropathic Pain,NPP)是由軀體感覺神經(jīng)系統(tǒng)的損傷或疾病造成的一種慢性疼痛[1]。其表現(xiàn)為自發(fā)性疼痛、痛覺過敏、異常疼痛和感覺異常等臨床特征[2]。許多疾病都能誘發(fā)神經(jīng)病理性疼痛,例如糖尿病、帶狀孢疹、麻風(fēng)病、HIV感染以及神經(jīng)根病變等。根據(jù)流行病學(xué)的研究,所有人群患有神經(jīng)病理性疼痛的概率高達(dá)6.9%-10%[3]。由于造成神經(jīng)病理性疼痛的因素種類繁多,因此其發(fā)生機(jī)制還不夠確切。目前關(guān)于神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生機(jī)制的研究主要集中在離子通道的改變、二階疼痛相關(guān)神經(jīng)元功能的改變以及抑制性中間神經(jīng)元功能的改變。超極化激活的環(huán)腺苷酸門控通道(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels,HCN)屬于電壓門控通道,有HCN1-4四個亞型。HCN通道只有在膜電位超極化時才被激活,進(jìn)而向內(nèi)產(chǎn)生一種興奮性電流,稱為Ih電流。Ih電流參與多種神經(jīng)活動,包括控制靜息膜電位,誘發(fā)神經(jīng)振蕩,調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放等[4]。研究顯示,HCN通道廣泛分布于痛覺傳導(dǎo)通路并在疼痛形成和發(fā)展過程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用[5]。炎性介質(zhì)PEG2可以加強(qiáng)HCN2的缺失對小的感覺神經(jīng)元動作電位的影響,而這些小的感覺神經(jīng)元中絕大部分都屬于痛覺感受器,這就說明HCN2在炎性疼痛中起著重要的作用。與此同時,神經(jīng)病理性疼痛會因為腺苷酸環(huán)化酶缺失、COX2受抑制、m PGES-1缺失得到緩解,而后兩者參與PEG2的合成[6]。以上研究結(jié)果示我們HCN2通道在參與炎性疼痛的同時還極有可能參與了神經(jīng)病理性疼痛。因此,本實驗擬采用脊神經(jīng)結(jié)扎損傷(SNL)這一經(jīng)典的神經(jīng)痛模型來證實HCN2是否參與了外周神經(jīng)病理性疼痛,并盡可能在此基礎(chǔ)上研究其機(jī)制。第一部分HCN2參與外周神經(jīng)病理性疼痛的初步研究目的:利用大鼠脊神經(jīng)結(jié)扎神經(jīng)痛模型,研究HCN2是否參與了外周神經(jīng)病理性疼痛。內(nèi)容:1.比較不同手術(shù)方法下大鼠脊神經(jīng)結(jié)扎模型的造模效果,并對最佳的造模方法進(jìn)行造模評價。2.通過藥理學(xué)方法檢測HCN2的非特異性抑制劑ZD7288是否有逆轉(zhuǎn)疼痛的效果。從而間接證明HCN2是否參與了外周神經(jīng)病理性疼痛。3.采用q PCR的方法檢測神經(jīng)痛模型大鼠DRG內(nèi)HCN2 m RNA的表達(dá)變化情況。4.采用Western blot的方法檢測神經(jīng)痛模型大鼠DRG內(nèi)HCN2通道蛋白的表達(dá)變化情況。方法:1.采用三種手術(shù)方法建立神經(jīng)痛模型:Sham組,將大鼠L4、L5脊神經(jīng)分離后,不作處理,直接縫合傷口;SNL組,用絲線結(jié)扎L5脊神經(jīng),L4脊神經(jīng)不作處理;m SNL組,用絲線結(jié)扎L5脊神經(jīng),用鉻制羊腸線在L4脊神經(jīng)上做輕度結(jié)扎;SNA組,用絲線結(jié)扎L5脊神經(jīng),并將結(jié)扎處DRG的遠(yuǎn)側(cè)端剪斷,再用鉻制羊腸線在L4脊神經(jīng)上做輕度結(jié)扎。手術(shù)一周后對大鼠進(jìn)行行為學(xué)評價。2.將造模成功后的大鼠進(jìn)行隨機(jī)分組(n=6),按如下方法進(jìn)行給藥試驗:陰性對照組(Saline),足底注射0.9%生理鹽水,注射劑量為500μl/kg;陽性對照組(GBPT),腹腔注射0.9%生理鹽水配制的加巴噴丁溶液,注射劑量為10mg/kg;治療組(ZD7288),足底注射0.9%生理鹽水配制的ZD7288溶液,注射劑量為15μg/kg。分別在給藥前和給藥后1h、4h、24h、48h五個時間點對大鼠進(jìn)行機(jī)械痛實驗、熱板實驗、自發(fā)抬足實驗。3.獲取神經(jīng)痛模型大鼠的DRG,取總RNA,再逆轉(zhuǎn)錄得到c DNA,然后進(jìn)行實時熒光定量PCR檢測HCN2 m RNA的變化情況。4.獲取神經(jīng)痛模型大鼠的DRG,取蛋白質(zhì),用Western blot的方法檢測HCN2通道蛋白的變化情況。結(jié)果:1.行為學(xué)的實驗結(jié)果顯示,本實驗建立的大鼠脊神經(jīng)結(jié)扎神經(jīng)痛模型能達(dá)到實驗要求。2.機(jī)械痛實驗、熱板實驗和自發(fā)抬足實驗發(fā)現(xiàn),對比生理鹽水組,陽性對照組GBPT和ZD7288治療組均能明顯的減輕大鼠神經(jīng)病理性疼痛的癥狀。3.q PCR以及Western blot的結(jié)果均顯示,對比正常大鼠,大鼠DRG內(nèi)的HCN2表達(dá)上調(diào)。結(jié)論:HCN2參與了神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生,研究其機(jī)制將為治療神經(jīng)病理性疼痛供理論基礎(chǔ)。第二部分HCN2條件敲除小鼠的建立及表型分析目的:建立HCN2條件敲除小鼠,為HCN2參與外周神經(jīng)病理性疼痛的機(jī)制研究供手段。內(nèi)容:1.根據(jù)Cre/Lox P重組酶系統(tǒng)的原理,利用hcn2基因的flox純合小鼠與NSE-Cre小鼠進(jìn)行兩輪雜交,得到HCN2的條件敲除小鼠。2.通過生長繁殖情況、行為學(xué)檢測對HCN2條件敲除小鼠進(jìn)行基本的表型分析。方法:1.用hcn2flox/+雜合子小鼠自交得到hcn2flox/flox,再用hcn2flox/flox與NSE-Cre小鼠雜交得到hcn2flox/+·cre+,然后用hcn2flox/flox與hcn2flox/+·cre+雜交得到hcn2flox/flox·cre+純合子小鼠。采用取鼠尾DNA進(jìn)行PCR的方法鑒定小鼠的基因型。2.利用免疫熒光的方法檢測HCN2的敲除情況。3.對比正常小鼠和HCN2條件敲除小鼠的外觀、體重等對敲除小鼠的生長發(fā)育能力進(jìn)行評價。4.利用曠場實驗、足跡實驗、滾軸實驗對HCN2敲除小鼠的行為能力進(jìn)行評價。5.利用熱板實驗對HCN2敲除小鼠進(jìn)行痛覺方面的評價。結(jié)果:1.成功繁育出hcn2flox/flox·cre+純合子小鼠。2.免疫熒光實驗結(jié)果證明HCN2敲除小鼠體內(nèi)的HCN2被部分敲除。3.HCN2條件敲除小鼠的生長發(fā)育、繁殖能力和正常小鼠無明顯差異。4.行為學(xué)實驗結(jié)果顯示HCN2條件敲除小鼠的行為能力和正常小鼠無明顯差異。5.熱板實驗結(jié)果顯示HCN2條件敲除小鼠在熱痛方面和正常小鼠無明顯差異。結(jié)論:本研究成功建立了HCN2條件敲除小鼠。但是HCN2在該小鼠體內(nèi)只有部分被敲除,其原因有待分析。雖然HCN2的敲除效果沒有達(dá)到我們的預(yù)期,但該小鼠仍然有一定的利用價值,可用于神經(jīng)病理性疼痛的研究。
【圖文】：

但是，患病人數(shù)的增加和治療效果不佳迫使我們不得不采用更多的治療方案。與此同時，神經(jīng)病理性疼痛臨床研究的匱乏導(dǎo)致醫(yī)生制定治療沒有可靠的理論依據(jù)。因此，研究神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生機(jī)制是刻不容緩CN 即超極化激活的環(huán)腺苷酸門控通道，它屬于電壓門控通道。1976 年[15]等在兔心臟竇房結(jié)觀察到了超極化激活的電流 Ih，之后在很多其他組織現(xiàn)了這種電流[16, 17]。但是，直到 1998 年產(chǎn)生 Ih電流的 HCN 通道才被ig[18]報道出來。HCN 通道的結(jié)構(gòu)如下圖[19]所示：它由四個亞基聚合成孔道基都含有 6 個跨膜結(jié)構(gòu)域，分別是 S1-S6。其中，S4 充當(dāng)電壓感受器，，和6 共同形成離子選擇性過濾器[20]。和 S6 相連的胞內(nèi) C 末端含有一個環(huán)核合結(jié)構(gòu)域（CNBD），它能結(jié)合 cAMP 直接對 HCN 通道進(jìn)行調(diào)控[21]。

使其適應(yīng)新的生活環(huán)境。成 4 組，并編號，其中 1-12 號為 Sham 組，1 mSNL 組，37-48 號為 mSNA 組。先進(jìn)行行為學(xué)檢測（包括機(jī)械痛實驗、熱板實法見后文），剔除痛覺過敏的大鼠。經(jīng)檢測，最為 12 只，mSNA 組為 11 只，mSNL 組為 11 只 1%戊巴比妥鈉使其麻醉，注射劑量為 0.6ml/1鈉注射到皮下或者內(nèi)臟。醉后，用電動理發(fā)器將大鼠背部毛發(fā)剔除，備頂端平第 6 腰椎，判斷大鼠第 4 和第 5 腰椎的。述記號處，稍微靠腰椎左側(cè)將大鼠外皮切開， 5 腰椎橫突，一般情況下可在橫突下方找到第去部分橫突，方便暴露脊神經(jīng)。(分離出的脊神
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R741

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 瞿祥薇;林顯光;王滔;李臣鴻;;HCN通道在神經(jīng)系統(tǒng)中的分布及功能[J];生理科學(xué)進(jìn)展;2015年02期

2 李招勝;林洪;沙漠;丁真奇;;神經(jīng)病理性疼痛的藥物治療研究進(jìn)展[J];中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué);2013年09期

本文編號：2571878